吳小源，胡曉娜，賀春語，楊原源，郝大選，李 雪，王建華

(1.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 放療科 河南鄭州 450008;2.河南省中醫(yī)學(xué)院三附院 醫(yī)學(xué)影像科 河南鄭州 450008)

細(xì)胞凋亡是由Caspase半胱氨酸蛋白酶家族引發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)的細(xì)胞自我破壞的程序性生化過程，對維持組織的正常形態(tài)結(jié)構(gòu)和機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要的作用，細(xì)胞凋亡出現(xiàn)異常最終會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Survivin和Bax是重要的細(xì)胞凋亡調(diào)控基因，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［1-2］。本研究通過免疫組織化學(xué)(SP)法檢測Survivin和Bax蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)，旨在探討其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集河南省腫瘤醫(yī)院2007年10月至2009年8月臨床資料完整的食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)病例58例，被檢測的腫瘤標(biāo)本均為石蠟包埋組織，其中手術(shù)標(biāo)本50例，胃鏡活檢病理組織8例。男37例，女21例;年齡38～80歲，中位年齡63歲;高、中、低分別為19例、25例、14例;采用2009年AJCC食管癌分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，Ⅰ期6例，Ⅱ期37例，Ⅲ期15例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例。所有患者均為初治，胃鏡檢查或手術(shù)前均未行放、化療。

1.2 研究方法 所有標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，制成3 μm厚的切片，采用免疫組化SP法進(jìn)行Survivin、Bax染色。Survivin兔抗人多克隆抗體、Bax鼠抗人單克隆抗體及免疫組化通用試劑盒均購自福州邁新公司。免疫組化染色按SP試劑盒操作說明進(jìn)行，以微波修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，工作液濃度均為1∶150。

1.3 評定標(biāo)準(zhǔn) Survivin和Bax陽性表達(dá)產(chǎn)物呈棕黃色細(xì)顆粒狀，主要定位在細(xì)胞質(zhì)。染色表達(dá)情況采用半定量法推算，按以下比例計分:腫瘤細(xì)胞染色陽性率為0%～4%計0分，5%～24%計1分，25%～49%計2分，50%～74%計3分，75%～100%計4分，染色強(qiáng)度用0(陰性)、1(弱陽性)和2(強(qiáng)陽性)來表示。各指標(biāo)的表達(dá)水平用腫瘤細(xì)胞染色陽性率與染色強(qiáng)度評分的乘積表示，具體結(jié)果統(tǒng)計按 Krajewska等［3］推薦的方法進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，不同臨床病理特征間同一指標(biāo)比較采用χ2檢驗，各指標(biāo)相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析;繪制Kaplan-Meier生存曲線，生存差異采用log-rank方法進(jìn)行比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Survivin、Bax蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系 Survivin和Bax蛋白陽性表達(dá)產(chǎn)物呈棕黃色顆粒位于食管鱗癌細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，以細(xì)胞質(zhì)為主，其陽性表達(dá)率分別為77.6%(45/58)和43.1%(25/58)。Survivin蛋白在高、中、低分化食管鱗癌組織中的陽性表達(dá)率分別為63.2%、76.0%和100.0%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.042)，而與性別、年齡、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期無關(guān)(P＞0.05)。Bax蛋白的表達(dá)與性別、年齡、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及分化程度均無關(guān)(P＞0.05)。見表1。

表1 Survivin和Bax蛋白的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(n，%)

2.2 Survivin、Bax蛋白在食管鱗癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 采用Spearman等級相關(guān)分析評價Survivin和Bax蛋白在食管鱗癌組織中表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示Survivin和Bax蛋白的表達(dá)無相關(guān)性(r=0.134，P=0.316)，見表2。

表2 Survivin和Bax蛋白表達(dá)的相關(guān)性(n)

2.3 Survivin、Bax蛋白對食管鱗癌預(yù)后的影響 全組58例食管鱗癌患者均完成隨訪，末次隨訪時間為2014年8月31日。全組1、3、5年生存率為93.1%、46.6%和27.5%，中位生存時間34.5個月。Survivin蛋白陽性組與陰性組患者的1、3、5年生存率分別為95.6%、46.7%、28.7%和84.6%、46.2%、23.1%，中位生存時間分別為35.2個月和26.6個月(P=0.560)(見圖1)。Bax蛋白陽性組與陰性組患者的1、3、5年生存率分別為92.0%、44.0%、24.0%和93.9%、48.5%、30.3%，中位生存時間分別為25.5 個月和35.6 個月(P=0.330)(見圖2)。

圖1 Survivin蛋白陽性組與陰性組預(yù)后比較

3 討論

圖2 Bax蛋白陽性組與陰性組預(yù)后比較

食管癌是人類常見的惡性腫瘤，惡性程度高，預(yù)后差，其發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡的失衡密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡是由Caspase半胱氨酸蛋白酶家族引發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)的細(xì)胞自我破壞的程序性生化過程，對維持組織的正常形態(tài)結(jié)構(gòu)和機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要的作用，受多種細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的調(diào)控。Survivin是凋亡抑制蛋白(IAP)家族成員之一，也是迄今發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的凋亡抑制因子。Survivin通過特異性地與Caspase-3和Caspase-7結(jié)合，抑制有活性的半胱天冬蛋白酶形成，從而發(fā)揮強(qiáng)大的抗凋亡作用，同時具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、參與細(xì)胞周期調(diào)控及促進(jìn)血管生成多方面的功能。理論上，Survivin在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)越強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞的惡性程度越高，局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力越強(qiáng)，從而導(dǎo)致患者生存期縮短，死亡率增高。

Survivin的表達(dá)具有組織選擇性，在胚胎組織和大多數(shù)人類腫瘤組織中都有表達(dá)，但在分化成熟的組織無表達(dá)。本研究中，Survivin在食管鱗癌組織中的陽性表達(dá)率為77.6%，與國內(nèi)程道博等［4］的報道接近，提示Survivin可能對食管癌的早期診斷具有潛在價值。Muzio等［5］報道在浸潤性鱗癌中，Survivin的表達(dá)和腫瘤分化程度、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。Cao等［6］對108例食管鱗癌患者外周血中Survivin的表達(dá)情況進(jìn)行研究，結(jié)果顯示循環(huán)血液中Survivin表達(dá)與腫瘤侵犯深度、血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期均相關(guān)(P＜0.05)。本研究中，高、中、低分化食管鱗癌的Survivin 陽性表達(dá)率分別為63.2%、76.0%和100.0%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與程道博［4］的報道一致。同時發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)陽性組的Survivin表達(dá)率高于淋巴結(jié)陰性組，隨著腫瘤侵犯深度及臨床分期的升高，Survivin的陽性表達(dá)率也逐漸提高，但均無統(tǒng)計學(xué)差異，考慮與樣本量小有關(guān)。本研究未發(fā)現(xiàn)Survivin的表達(dá)與患者的性別和年齡有關(guān)，與曹富民等［7］的結(jié)果一致。Ikeguchi等［8］在對53例食管鱗癌患者的研究中發(fā)現(xiàn)，17例Survivin mRNA高表達(dá)者與36例Survivin mRNA低表達(dá)者的5年生存率分別為14.1%和46.8%(P=0.001 8)，結(jié)論為Survivin mRNA的表達(dá)是獨立于分期之外評估食管癌預(yù)后的一個良好生物指標(biāo)。Cao等［6］發(fā)現(xiàn)循環(huán)血液中Survivin陽性患者腫瘤復(fù)發(fā)率高，生存率低，認(rèn)為術(shù)后監(jiān)測食管癌患者的Survivin表達(dá)情況可作為腫瘤復(fù)發(fā)的預(yù)測標(biāo)志。但本研究中，Survivin蛋白陽性組與陰性組患者的1、3、5年生存率分別為95.6%、46.7%、28.7%和84.6%、46.2%、23.1%，中位生存時間分別為35.2個月和26.6個月，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

Bax是原癌基因Bcl-2家族的一員，其編碼的蛋白21%與Bcl-2同源，生物學(xué)作用是拮抗Bcl-2基因，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。當(dāng)Bax在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)時，細(xì)胞對死亡信號的反應(yīng)增強(qiáng)，細(xì)胞死亡增多［9］。目前關(guān)于Bax在食管癌中的表達(dá)及作用仍存在爭議［10-14］。Kang等［12］報道Bax在食管癌中的高表達(dá)率為67.0%(42/63)，與放化療后的臨床完全緩解率密切相關(guān)，而與年齡、分期等無關(guān)，單因素分析顯示Bax低表達(dá)與預(yù)后不良密切相關(guān)(P=0.000 8)，多因素分析認(rèn)為Bax低表達(dá)是局部進(jìn)展期食管癌預(yù)后不良的最強(qiáng)獨立因子(P=0.009)。Kurabayashi等［13］報道，Bax 在食管鱗癌中的陽性表達(dá)率為82.9%(63/76)，與性別、年齡、腫瘤侵犯深度、血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期均無關(guān)，Bax陰性組的生存反而優(yōu)于Bax陰性組(P=0.043)。本研究中，Bax在食管鱗癌組織中的陽性表達(dá)率為43.1%，其表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤侵犯深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期均無關(guān)，Bax蛋白陽性組與陰性組患者的1、3、5年生存率無顯著性差異(P=0.330)，與Natsugoe等［14］的研究結(jié)果相似?？紤]造成Bax蛋白在食管癌中的表達(dá)程度及其作用不完全相同甚至完全相反的原因可能與樣本大小、病例選擇、實驗方法及判斷標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)，亦有可能是Bax在食管癌的不同階段所起的作用不同造成的。

Survivin和Bax在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中的作用不同，是一對作用相反的凋亡抑制與促進(jìn)基因，兩者之間的平衡對細(xì)胞凋亡有重要作用。本研究中，Bax表達(dá)陽性及陰性的食管鱗癌組織中，Survivin陽性表達(dá)率均無顯著性差異(r=0.134，P=0.316)，提示 Survivin和Bax基因可能通過各自不同的機(jī)制參與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，Survivin蛋白在食管鱗癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，與食管鱗癌的分化程度密切相關(guān)，可能在食管鱗癌的發(fā)展過程中起重要作用，有待大樣本臨床研究來進(jìn)一步驗證。

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