郭 波，王文靜，趙凌宇，常素娥，童東東，楊 陽，宋土生，黃辰，3*

(1西安交通大學醫(yī)學院遺傳學與分子生物學系，西安 710061;2西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院肝膽外科;3西安交通大學醫(yī)學院心血管研究中心;*通訊作者，E-mail:hchen@mail.xjtu.edu.cn)

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一。據(jù)2000年資料統(tǒng)計，全球每年新發(fā)胃癌876 000例，占所有新發(fā)癌癥病例的9%，僅次于肺癌、乳腺癌和腸癌，位居第4位。每年約有647 000人因胃癌死亡，位居癌癥死因的第2位［1］。我國是胃癌高發(fā)大國，約有35%的胃癌病例發(fā)生在中國，中國人群胃癌死亡率高達24.65/10萬［2］。由于其惡性程度高、發(fā)病隱匿、病情進展快、易復發(fā)、易轉(zhuǎn)移等生物學特性，且大部分胃癌患者臨床確診時已屬晚期，所以手術(shù)、放療、化療等各種治療方法效果均不佳，胃癌已成為威脅人類健康最難治療的疾病之一，且其發(fā)病率和死亡率呈逐年升高的趨勢。因此，研究胃癌的發(fā)生機制、尤其是胃癌發(fā)生過程中基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)機制，對尋找胃癌治療的新藥物，提高胃癌患者的預后具有重要意義。

微小RNA(microRNA)是一類進化上高度保守的單鏈非編碼RNA小分子，由21－25個核苷酸組成，廣泛存在于真核生物中［3］。主要通過抑制mRNA翻譯或促進其降解從而調(diào)控基因表達，調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、侵襲轉(zhuǎn)移及凋亡，參與機體的發(fā)育、代謝以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等生物學過程，其與癌癥發(fā)生的關(guān)系更是癌癥研究新的熱點內(nèi)容［4］。因此，本研究采用real-time PCR方法檢測了hsa-miR-106a在胃癌組織及正常對照組織中的表達情況，以分析hsamiR-106a對胃癌發(fā)生機制、發(fā)展過程的影響，為探討胃癌發(fā)病機制和診斷治療的研究提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

19對胃癌及正常對照組織(距離癌灶邊緣5 cm以上，病理證實為非腫瘤組織)標本取自西安交通大學第一附屬醫(yī)院2011－03～2011－11間手術(shù)患者，平均年齡為(61.55±2.18)歲。所有患者均為原發(fā)性病灶切除，術(shù)前未經(jīng)放化療處理，簽署知情同意書。經(jīng)術(shù)后病理檢查證實后，對19例患者的臨床病理資料進行整理分析。標本采集后經(jīng)甲醛固定通過石蠟包埋進行長期保存。

1.2 引物設(shè)計與合成

miRNA與內(nèi)參的反轉(zhuǎn)錄及real－time PCR引物序列由本實驗室設(shè)計提供，引物合成由生工生物工程(上海)公司完成，序列見表1。

1.3 RNA的提取與鑒定

每個樣本的石蠟包埋組織取20μm厚度3－4張切片脫蠟，按石蠟組織試劑盒(RecoverAllTMTotal Nucleic Acid Isolation Kit，USA，Ambion 公司)說明書方法操作并檢測OD值，A260/A280比值均在1.8－2.2之間，為高純度 RNA，并調(diào)整 RNA濃度，置于－80℃保存。

表1 miRNA反轉(zhuǎn)錄與定量PCR引物Table 1 Primers for reverse transcription(RT)quantitative polymerase chain reaction of microRNAs and U6

1.4 逆轉(zhuǎn)錄PCR

利用本實驗已設(shè)計的帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的特異性RT引物，逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。按試劑盒(PrimeScript? RT reagent Kit Perfect Real Time，JAP，TAKARA 公司)說明反應(yīng)體系共10μl，RNA 約為40 ng，2μl 5×PrimeScript? Buffer，0.5 μl PrimeScript? RT Enzyme MixⅠ，1μl Reverse transcription引物，添加 RNase Free water調(diào)整體系至10μl。反應(yīng)條件37℃ 15 min，85℃ 5 s，反應(yīng)產(chǎn)物保存于4℃。

1.5 實時熒光定量PCR

采用試劑盒(SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)，TAKARA)，反應(yīng)體系為20 μl:1 μl逆轉(zhuǎn)錄 PCR產(chǎn)物，10μl 2×SYBR? Premix Ex TaqTMII，上下游引物各1 μl，加 RNase Free water調(diào)整體系至20μl，設(shè)置U6做為內(nèi)參，每組樣本均做3個重復，反應(yīng)在IQ－5型(Bio-Rad)實時熒光定量PCR儀上進行。

1.6 數(shù)據(jù)分析

讀取定量 PCR 反應(yīng) Ct值，計算 2－ΔΔCt(ΔCt=CtmiRNA-CtU6，microRNA 的相對表達量以 2－ΔΔCt計)。采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行分析，以±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用單因素方差分析，比較miR-106a在不同臨床分期和病理分級胃癌中表達的差異，P＜0.05視為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 real-time PCR結(jié)果分析

將19對標本一一對應(yīng)，分別計算出癌組織相對于正常對照組織的2－ΔΔCt，結(jié)果表明miR-106a在癌組織中有14例高表達，5例低表達(見圖1)，統(tǒng)計學分析表明，兩組間具有統(tǒng)計學差異(P＜0.01，見圖2)。

圖1 miR-106a在19例胃癌組織中表達Figure 1 Expression of miR-106a in 19 cases of gastric cancer

圖2 miR-106a表達在胃癌組織中顯著高于正常組織Figure 2 Expression of miR-106a in gastric cancer and normal tissues

2.2 胃癌組織中miR-106a表達與臨床病理特征的關(guān)系

分析結(jié)果顯示，在已獲得胃癌組織中miR-106a的表達量與腫瘤分化程度有相關(guān)性(P＜0.05)，但與年齡、性別、侵襲度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠端轉(zhuǎn)移和病理分期等都無關(guān)(見表2)。

3 討論

胃癌的發(fā)生是一種多因素參與、多基因改變的事件，抑癌基因失活、DNA修復基因丟失、基因突變導致細胞周期改變、基因抑制細胞凋亡等均可導致胃癌發(fā)生，與胃癌相關(guān)的癌基因就多達400多種。已有研究證實，k-ras、p53 和e-Cadherin 基因的突變［5，6］，cmet、cyclin-E 以及 ERBB2 的擴增［7，8］，EGFR、TGF-beta、VEGF 基因的過表達均與胃癌發(fā)生有關(guān)［9，10］?？傊?，多種因素相互疊加，最終導致胃癌發(fā)生。

表2 胃癌中miR-106a與臨床病理特征的關(guān)系(±s)Table 2 Correlation of of miR-106a expression with clinicopathological factors(±s)

表2 胃癌中miR-106a與臨床病理特征的關(guān)系(±s)Table 2 Correlation of of miR-106a expression with clinicopathological factors(±s)

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微小RNA(microRNA)大部分由基因的內(nèi)含子部位產(chǎn)生，主要通過抑制mRNA翻譯或促進其降解從而調(diào)控基因表達。目前的研究表明，miRNA分子通過兩種不同機制調(diào)節(jié)蛋白的表達。當miRNA和編碼蛋白質(zhì)的mRNA幾乎完全配對時，miRNA誘導mRNA降解，這種miRNA介導的基因沉默機制在植物中比較普遍。當miRNA和編碼蛋白質(zhì)的mRNA不完全配對時，miRNA通過不完全的堿基配對結(jié)合mRNA的3’非編碼區(qū)(3’UTR)，在轉(zhuǎn)錄水平上抑制基因翻譯［11］。從而調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、侵襲轉(zhuǎn)移及凋亡，參與機體的發(fā)育、代謝以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等生物學過程，其與癌癥發(fā)生的關(guān)系更是癌癥研究新的熱點內(nèi)容。對胃癌中人類let-7a進行定量，結(jié)果顯示胃癌組織中的表達水平顯著比正常組織低，并通過與RAB40C基因3’UTR結(jié)合影響胃癌細胞生物學特性，提示let-7a在胃癌的發(fā)展中起重要作用［12］。

近期的研究表明，miR-106a在結(jié)腸直腸癌［13］、卵巢癌［14］、惡性膠質(zhì)瘤［15］等多種類型的腫瘤組織中高表達，其表達調(diào)控的信號通路在調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用。而在星形細胞瘤中，通過對84例瘤體及20例癌旁正常組織中miR-106a表達量的檢測，發(fā)現(xiàn)miR-106a的低表達與患者的預后存在密切的關(guān)系［16］。正是基于以上事實，本研究利用qRT-PCR方法檢測了miR-106a在胃癌及其正常組織中的表達量，發(fā)現(xiàn)miR-106a在胃癌組織相對于正常組織有明顯的表達上調(diào)，這種趨勢與已有的研究報道一致［17］，同時這種差異表達與臨床病理指征有密切相關(guān)性。而最新的研究結(jié)果［18］表明，miR-106a不僅在胃癌組織中存在普遍的上調(diào)，還能通過FAS介導的信號通路調(diào)控胃癌細胞的生長，抑制miR-106a表達不僅能阻滯腫瘤細胞的增殖，還能誘導腫瘤細胞的凋亡。

本研究中采用real-time PCR檢測miR-106a在胃癌組織中的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-106a在胃癌中的表達較正常組織明顯升高(P＜0.01)。同時，miR-106a的高表達與腫瘤分化程度有著密切的相關(guān)性(P＜0.05)。以上結(jié)果說明miR-106a可能參與了胃癌的發(fā)生和發(fā)展過程，受限于樣本數(shù)量較少，未能就miR-106a與胃癌的病理分級、臨床分期及預后情況等進行深入的分析。但本實驗結(jié)果為我們提供了在胃癌分子機制研究中一個潛在的靶點，下一步，我們將就miR-106a與其靶基因在胃癌細胞系中的效應(yīng)進行深入分析和實驗驗證，為進一步理解胃癌的發(fā)生和發(fā)展機制，尋找對胃癌診斷、判斷預后和治療靶標有價值的分子標志物奠定良好的基礎(chǔ)。

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