陳喜英，郭永昌，劉田福

(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，太原 030001;*通訊作者，E-mail:13603518575@163.com)

近年來，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的迅速發(fā)展和成熟，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在生物醫(yī)藥、生命科學(xué)研究領(lǐng)域得到越來越廣泛的應(yīng)用。國際上報(bào)道了多種得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，目前真正成熟并可以穩(wěn)定得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法主要有三種，即原核顯微注射法、精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法和核移植。其中，顯微注射法是轉(zhuǎn)基因最簡單、最常用的的方法，其操作步驟包括受精卵的采集、顯微注射和胚胎移植。要取得原核顯微注射的高成功率首先要得到質(zhì)量好、數(shù)量多的原核期受精卵。小鼠在生理狀態(tài)下一次排卵10－15顆，遠(yuǎn)不能滿足實(shí)驗(yàn)的需要。為了增加可獲得的卵子數(shù)量，用孕馬血清(PMSG)模擬促卵泡激素，用人絨毛膜促性腺激素(HCG)模擬黃體生成素(LH)可以誘發(fā)交配雌鼠排卵多于正常排卵數(shù)即超排卵。超排反應(yīng)是一個(gè)由一系列極其復(fù)雜的生理過程累積而產(chǎn)生的結(jié)果，影響因素諸多［1］，包括動(dòng)物遺傳特性、體況、營養(yǎng)狀態(tài)、年齡、發(fā)情周期的階段、卵巢的功能狀態(tài)、季節(jié)、溫度以及激素劑量等。已有多個(gè)實(shí)驗(yàn)室對超排反應(yīng)的條件進(jìn)行了摸索［2－5］。受精卵的數(shù)量和質(zhì)量主要取決于促性腺激素的注射時(shí)間及用量，小鼠品系、鼠齡及體重等。為了進(jìn)一步探討有效的小鼠超排卵方法，我們在控制其他條件一致的情況下，對給予激素的時(shí)間做了實(shí)驗(yàn)分析，以求找到一個(gè)最適宜的注射時(shí)間，能得到最大數(shù)量及最好質(zhì)量的可用于顯微注射的受精卵。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)昆明系白小鼠雌雄各40只，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):SCXK(晉2009－0001);雌鼠作為供體鼠，5周齡，體重20－25 g;雄鼠8周齡，體重35 g左右。動(dòng)物房飼養(yǎng)環(huán)境溫度20－24℃，相對濕度50%－55%，光照周期7:30－19:30，正常飼料及飲水。

1.2 主要試劑與器材

M2培養(yǎng)液，M16培養(yǎng)液，透明質(zhì)酸酶，礦物油均購自美國 Sigma公司，孕母馬血清(PMSG)，人絨毛膜促性腺激素(HCG)均購自寧波激素制藥廠;體視顯微鏡(Motic)、毛細(xì)玻璃管(NarisHige)、精細(xì)鑷子(Dumont)等各種手術(shù)器械。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組、給藥 40只雌性小鼠編號(hào)，隨機(jī)分為4組，經(jīng)檢驗(yàn)組間差異不顯著，4組編號(hào)為1，2，3，4。按試驗(yàn)方案給藥，分別與雄鼠合籠，檢栓。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)方案 第1天:11:00，13:00，15:00，17:00分別給1，2，3，4組雌鼠腹腔注射PMSG 5 IU。

第3天:11:00，13:00，15:00，17:00 分別給 1，2，3，4組雌鼠腹腔注射HCG 5 IU，然后立即與雄鼠合籠(雌雄比例為1∶1)。

第4天:于8:00檢查所有雌鼠陰栓，記錄見栓小鼠編號(hào)和數(shù)目。

1.3.3 獲取受精卵 依組別脫臼處死見栓小鼠，75%酒精體表消毒后開腹;緩慢牽拉子宮暴露輸卵管，剪下輸卵管，將其置于M2液滴中，于鏡下撕破膨大壺腹部，釋放出受精卵。經(jīng)300μg/ml的透明質(zhì)酸酶消化后計(jì)算每只小鼠受精卵數(shù)量。

1.3.4 胚胎體外培養(yǎng) 將洗好的受精卵轉(zhuǎn)移至平衡好的M16液滴中，置于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)過夜，第2天計(jì)算每只小鼠獲得二細(xì)胞胚胎數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

四組小鼠在不同時(shí)間注射PMSG和HCG發(fā)生超排反應(yīng)后獲得的胚胎數(shù)，具體結(jié)果見表1。

表1 不同激素注射時(shí)間對小鼠超排效果的影響(±s)Table 1 Effect of the different administration time of PMSG，HCG on the superovulation in mouse(±s)

表1 不同激素注射時(shí)間對小鼠超排效果的影響(±s)Table 1 Effect of the different administration time of PMSG，HCG on the superovulation in mouse(±s)

與其余各組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

2 13∶00 10 9 90* 256 25.60±2.731* 248 24.80±1.737 3 15∶00 10 5 50 138 13.80±1.868 115 11.50±3.277 4 17∶00 10 2 20 66 6.60±1.490 47 4.70±2.736

由表1可以看出，第2組(11:00組)平均獲胚胎數(shù)和Ⅱ－細(xì)胞胚胎數(shù)均為最高，分別為25.6和24.8，而第4組(17:00組)平均獲胚胎數(shù)和2－細(xì)胞胚胎數(shù)均為最低，分別為6.6和4.7。

經(jīng)F檢驗(yàn)得，四組間超排效果差異顯著，其中第2組與第1，3，4組間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。

3 討論

小鼠的超排卵是科學(xué)研究中得到卵母細(xì)胞和胚胎的常規(guī)方法。有報(bào)道認(rèn)為5 IU PMSG+5 IU HCG劑量組合對小鼠超排效果最好［6，7］。當(dāng)PMSG劑量過低時(shí)，不能有效促進(jìn)較多卵母細(xì)胞同時(shí)發(fā)育，也就達(dá)不到超排效果;相反，激素劑量過大則會(huì)引起卵巢“過刺激”而使卵母細(xì)胞的排放率降低，產(chǎn)生抑制作用。

PMSG與HCG間有著相互影響，且也與動(dòng)物房的明暗周期有關(guān)，所以他們的注射時(shí)間會(huì)影響到排卵的數(shù)目及發(fā)育的一致性。目前，小鼠超數(shù)排卵第一次注射激素采用的時(shí)間并不統(tǒng)一［8－10］，超排數(shù)量獲卵數(shù)一般為20－30枚。小鼠的發(fā)情受環(huán)境影響，尤其是光照控制，在穩(wěn)定的光控條件下，排卵一般發(fā)生在黑暗后的3－5 h［11］。本試驗(yàn)所用小鼠在自然光照暗循環(huán)為19∶30至7∶30條件下飼養(yǎng)，動(dòng)物房明暗循環(huán)條件能影響外源激素刺激內(nèi)源激素的釋放［12］。在相同暗循環(huán)條件下，激素不同注射時(shí)間對小鼠超排有一定影響，HCG應(yīng)在內(nèi)源性的LH釋放之前腹腔注射［13］。而內(nèi)源性LH的釋放是在PMSG的刺激下由明暗周期控制的。我們比較了不同時(shí)間注射PMSG及HCG，發(fā)現(xiàn)在第1天13∶00注射5 IU的PMSG，48 h后注射5 IU HCG，第4天早上收集卵，獲得的受精卵正常發(fā)育成二細(xì)胞最多。這樣可以保證HCG至少比內(nèi)源性的LH早2－3 h進(jìn)入體內(nèi)。

以不同起始時(shí)間超排小鼠，其排卵、受精及早期胚胎發(fā)育時(shí)程具有規(guī)律性，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在4個(gè)不同起始時(shí)間超排小鼠所得的排卵數(shù)呈現(xiàn)出不同程度的差異。其中原因?yàn)?，所挑選小鼠的發(fā)情周期階段均為發(fā)情前期，發(fā)情前期持續(xù)的時(shí)間為17－24 h［2］，部分實(shí)驗(yàn)小鼠處于發(fā)情前期早期，部分已經(jīng)處于發(fā)情前期末期，處于發(fā)情前期不同階段的小鼠，其卵巢卵泡的發(fā)育狀況各不相同，導(dǎo)致了其在超排激素作用后的排卵時(shí)間有所差異，從而影響了隨后的受精及胚胎發(fā)育時(shí)程。其次，小鼠本身存在個(gè)體差異，對超排激素刺激的反應(yīng)和對激素的耐受能力不同，導(dǎo)致促性腺激素對個(gè)體作用效果不同，從而出現(xiàn)個(gè)體之間排卵、受精和胚胎發(fā)育時(shí)間不一致，在同一個(gè)體也存在排卵時(shí)間不整齊、受精時(shí)間不一致甚至胚胎發(fā)育時(shí)程并非同步進(jìn)行的現(xiàn)象，卵母細(xì)胞及早期胚胎的數(shù)量也有所差別。在一定程度上也會(huì)對小鼠排卵、受精及胚胎發(fā)育時(shí)程整體的規(guī)律性造成影響。但主要原因還是與小鼠自然狀態(tài)下發(fā)情與交配的生理周期相關(guān)。

以13:00為起始時(shí)間超排小鼠，其胚胎發(fā)育時(shí)程趨勢規(guī)律性最顯著，這與小鼠自然發(fā)情的生理特性相關(guān)。在注射 PMSG 48 h后，卵巢卵泡受到PMSG的刺激，大部分已發(fā)育成為排卵前卵泡，此時(shí)給予HCG注射，可進(jìn)一步促進(jìn)卵泡排卵。所以以13:00為起始時(shí)間超排，其超排效果較為理想，排卵、受精、胚胎發(fā)育規(guī)律性最為顯著。

超排是一個(gè)極為復(fù)雜的過程，影響因素很多，主要有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的品系、激素劑量、PMSG和HCG注射的間隔時(shí)間以及動(dòng)物的年齡和生殖健康狀態(tài)等［14－17］。本文僅就激素注射時(shí)間進(jìn)行探討，說明激素的注射時(shí)間對超排有明顯影響。其他因素，如激素的生物活性，動(dòng)物的某些因素如小鼠的品系，周齡，體重及內(nèi)分泌活動(dòng)對超排效果也將產(chǎn)生更直接的影響，今后還有待進(jìn)一步研究。

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