于 萍，孫 萌，傅常娥，陳艷秋，尹勇剛

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

大球蓋菇 (Stropharia rugosoannulata Farlow)，別名皺環(huán)球蓋菇、皺球蓋菇、酒紅大球蓋菇、裴氏球蓋菇、裴氏假黑傘，屬于擔(dān)子菌亞門(mén) (Basidomycota)、層菌綱 (Hymenomycetes)、傘菌目 (Agaricales)、球蓋菇科 (Strophariaceae)、球蓋菇屬 (假黑傘屬)(Stropharia)[1]。大球蓋菇色澤艷麗，子實(shí)體肉質(zhì)嫩滑、爽口，菌蓋細(xì)膩軟滑，菌柄清香脆甜，干菇香味濃郁。大球蓋菇主要分布于歐洲、北美洲、亞洲等地，是許多歐美國(guó)家人工栽培的食用菌之一，也是國(guó)際菇類(lèi)交易市場(chǎng)的十大菇類(lèi)之一和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)向發(fā)展中國(guó)家推薦栽培的重要食用菌之一[2]。大球蓋菇是一種美味食用菌，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，而且還有一定的保健和藥用價(jià)值[3，4]。

大球蓋菇對(duì)秸稈、樹(shù)枝等農(nóng)林廢棄物具有很好的降解能力，可生料栽培，但與其降解木質(zhì)纖維素密切相關(guān)的胞外酶活性變化的研究至今未見(jiàn)報(bào)道。雖然我國(guó)引種大球蓋菇較晚，但地理氣候適宜，并且秸稈、稻草等農(nóng)業(yè)廢棄物來(lái)源豐富，成本低廉，具有極大的栽培大球蓋菇的優(yōu)勢(shì)和潛力。大力發(fā)展大球蓋菇，可促進(jìn)農(nóng)業(yè)廢棄物的合理利用，減少其帶來(lái)的環(huán)境污染，同時(shí)減少對(duì)木材及木材下腳料的應(yīng)用，避免由于發(fā)展食用菌產(chǎn)業(yè)而造成的毀林現(xiàn)象，可帶來(lái)可觀的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益[5]。大球蓋菇生料栽培期間胞外酶活性變化的研究，將對(duì)深入研究其營(yíng)養(yǎng)生理和指導(dǎo)其栽培具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌種來(lái)源

供試的大球蓋菇菌株采自長(zhǎng)白山地區(qū)，經(jīng)組織分離后獲得純菌株，由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院應(yīng)用真菌實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 大球蓋菇栽培種制作

栽培種共設(shè)置5種培養(yǎng)料配方，以稻草、豆秸稈、玉米秸稈、玉米芯及木屑為主料，蔗糖、石膏粉為輔料，按照栽培種培養(yǎng)料配方進(jìn)行常規(guī)拌料、裝桶，含水量保持在65%～75%，選取菌絲長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良且一致的大球蓋菇原種制作栽培種，每個(gè)處理重復(fù)3次。

栽培種培養(yǎng)料分為1號(hào):木屑98%、蔗糖1%、石膏粉1%;2號(hào):稻草98%、蔗糖1%、石膏粉1%;3號(hào):豆秸稈98%、蔗糖1%、石膏粉1%;4號(hào):玉米秸稈98%、蔗糖1%、石膏粉1%;5號(hào):玉米芯98%、蔗糖1%、石膏粉1%。

1.3 取樣時(shí)期

在大球蓋菇生長(zhǎng)過(guò)程中，分別在接種期、發(fā)菌期、菌絲生長(zhǎng)前期、菌絲生長(zhǎng)中期、菌絲生長(zhǎng)后期、滿(mǎn)桶期、覆土期、原基期、子實(shí)體成熟期及間期共10個(gè)時(shí)期進(jìn)行取樣。

1.4 粗酶液的提取

在菌絲生長(zhǎng)發(fā)育的不同階段，分別在3個(gè)重復(fù)中取發(fā)菌料充分混勻，然后準(zhǔn)確稱(chēng)取20 g加蒸餾水100 mL，20℃下浸提4 h，過(guò)濾，4 000 r·min－1離心5 min，取上清液即為粗酶液。另外同樣稱(chēng)取20 g發(fā)菌料于熱鼓風(fēng)干燥箱中80℃烘干至恒重。

1.5 酶活性的測(cè)定

羧甲基纖維素酶 (CMC酶)和濾紙纖維素酶 (FP酶)活性測(cè)定參照Mandels等[6]的方法;β－葡糖糖苷酶活性測(cè)定參照Saswati等[7]的方法;半纖維素酶 (HC酶)活性測(cè)定參照Shamala等[8]的方法;漆酶活性測(cè)定:向3支樣品管中加入0.5 mL的3.36 mmol·L－1鄰聯(lián)甲苯胺 (用95%的乙醇溶解)作為底物，隨后向4支試管中加入3.4 mL的0.1 mol·L－1乙酸鹽緩沖液 (pH4.6)及0.5 mL粗酶液，置于28℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min，取出后在600 nm處測(cè)定吸光值。

漆酶活力單位定義:1 g干培養(yǎng)物中的酶量每分鐘使OD600值改變0.01為1個(gè)活力單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)料栽培大球蓋菇期間CMC酶活性變化

測(cè)定不同培養(yǎng)料栽培大球蓋菇期間CMC酶活性變化，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可見(jiàn)，大球蓋菇在不同培養(yǎng)料中均在菌絲生長(zhǎng)中期、子實(shí)體成熟期產(chǎn)生了酶活性高峰。其中2號(hào)和4號(hào)培養(yǎng)料中酶活性最強(qiáng)，在菌絲生長(zhǎng)中期分別達(dá)到了44.8 U和44.5 U。隨后，酶活性急速下降，在產(chǎn)生原基后再次上升，在子實(shí)體成熟期達(dá)到第2個(gè)峰值，其中2號(hào)稻草培養(yǎng)料酶活性最高，為39.0 U。1號(hào)和5號(hào)培養(yǎng)料中CMC酶活性相對(duì)較低。

2.2 不同培養(yǎng)料栽培大球蓋菇期間FP酶活性變化

不同培養(yǎng)料栽培大球蓋菇期間FP酶活性變化見(jiàn)圖2。

由圖2可見(jiàn)，不同培養(yǎng)料中大球蓋菇產(chǎn)生的FP酶活性差異較大，但變化趨勢(shì)相似。在發(fā)菌期2號(hào)培養(yǎng)料中酶活性最大 (35.2 U);在菌絲生長(zhǎng)期4號(hào)培養(yǎng)料中酶活性達(dá)到最大，為42.7 U;在子實(shí)體成熟期酶活性再次升高，隨后下降。這說(shuō)明在發(fā)菌期、菌絲生長(zhǎng)期和子實(shí)體成熟期纖維素被大量分解利用，間期酶活性下降，菌絲對(duì)纖維素的分解能力降低。1號(hào)與5號(hào)培養(yǎng)料中FP酶活性沒(méi)有明顯的波動(dòng)，酶活性一直較低。

2.3 不同培養(yǎng)料栽培大球蓋菇期間β－葡萄糖苷酶活性變化

不同培養(yǎng)料栽培大球蓋菇期間β－葡萄糖苷酶活性變化情況見(jiàn)圖3。

由圖3可以看出，在大球蓋菇整個(gè)栽培過(guò)程中，不同培養(yǎng)料中β－葡萄糖苷酶活性趨勢(shì)趨于一致，沒(méi)有明顯的酶活性高峰和明顯的階段性變化。最大值出現(xiàn)在菌絲生長(zhǎng)前期，2號(hào)培養(yǎng)料中酶活性達(dá)到24.2 U。

2.4 不同培養(yǎng)料栽培大球蓋菇期間HC酶活性變化

不同培養(yǎng)料栽培大球蓋菇期間HC酶活性變化情況見(jiàn)圖4。

由圖4可見(jiàn)，大球蓋菇生長(zhǎng)過(guò)程中，HC酶分別在菌絲生長(zhǎng)前期和子實(shí)體成熟期出現(xiàn)了酶活性高峰，其它時(shí)期酶活性較低。2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)培養(yǎng)料中HC酶活性在菌絲生長(zhǎng)前期達(dá)到高峰，分別為13.1 U、9.0 U和8.7 U;1號(hào)與5號(hào)培養(yǎng)料一直保持較低的酶活性。原基形成后各培養(yǎng)料中HC酶活性出現(xiàn)第2個(gè)高峰，2號(hào)培養(yǎng)料的酶活性最高，達(dá)8.7 U。

2.5 不同培養(yǎng)料栽培大球蓋菇期間漆酶活性變化

不同培養(yǎng)料栽培大球蓋菇期間漆酶活性變化情況見(jiàn)圖5。

由圖5可見(jiàn)，3號(hào)培養(yǎng)料在發(fā)菌期漆酶活性迅速上升，而2號(hào)、4號(hào)培養(yǎng)料中菌絲分泌的胞外漆酶在菌絲生長(zhǎng)前期迅速上升，并且與3號(hào)培養(yǎng)料在此時(shí)期均達(dá)到峰值，分別為6.1 U、5.4 U和4.2 U，隨后酶活性迅速下降并一直保持較低水平，直至覆土后出現(xiàn)上升趨勢(shì)，在子實(shí)體成熟期達(dá)到第2個(gè)活性高峰，此時(shí)稻草培養(yǎng)料中酶活性最高，為5.0 U。1號(hào)與5號(hào)培養(yǎng)料中酶活性一直較低。

3 討論

大球蓋菇屬于草腐食用菌，人工栽培營(yíng)養(yǎng)來(lái)源主要是從稻草、麥稈、玉米秸稈等培養(yǎng)基質(zhì)中分解獲得。培養(yǎng)基中的大分子物質(zhì)主要包括纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等成分。從本試驗(yàn)結(jié)果看出，在大球蓋菇生長(zhǎng)的全過(guò)程中均能測(cè)出胞外CMC酶、FP酶、β－葡萄糖苷酶、HC酶和漆酶活性。這些胞外酶是分解培養(yǎng)基中大分子物質(zhì)的生理生化基礎(chǔ)，尤其是在以木質(zhì)纖維素為主要營(yíng)養(yǎng)來(lái)源的環(huán)境中賴(lài)以生存的保證。大球蓋菇生料栽培期間，不同的栽培基質(zhì)中各個(gè)酶的活性變化規(guī)律基本一致，除了β－葡萄糖苷酶活性無(wú)明顯變化外，其他酶均在菌絲生長(zhǎng)期和子實(shí)體發(fā)育期活性較高，這與菌絲生長(zhǎng)和子實(shí)體發(fā)育需要大量營(yíng)養(yǎng)有關(guān)。CMC酶與FP酶在菌絲生長(zhǎng)中期和子實(shí)體成熟期酶活性最高，HC酶與漆酶在菌絲生長(zhǎng)前期和子實(shí)體成熟期酶活性最高。HC酶是水解半纖維素的酶，漆酶是水解木質(zhì)素的主要酶類(lèi)，在高等植物中，木質(zhì)素和半纖維素一起包圍著纖維素，對(duì)纖維素有物理性的屏障作用[9]，在木質(zhì)纖維素降解過(guò)程中會(huì)首先分解半纖維素和木質(zhì)素，因此HC酶和漆酶先達(dá)到酶活性高峰，之后出現(xiàn)纖維素酶活性高峰，這與一些學(xué)者對(duì)平菇、金頂側(cè)耳、姬松茸、滑菇、灰樹(shù)花、香菇等的研究結(jié)果相似但也存在差異[10－14]。平菇等食用菌的胞外酶活性在子實(shí)體成熟期遠(yuǎn)高于菌絲生長(zhǎng)期，而大球蓋菇菌絲生長(zhǎng)期間胞外酶活性略高于子實(shí)體成熟期，可能是由于大球蓋菇采用的是生料栽培，而其他食用菌采用的是發(fā)酵料栽培或者熟料栽培的原因。

綜合幾種酶的變化趨勢(shì)可以看出，在菌絲生長(zhǎng)期和子實(shí)體發(fā)育期酶活性較高，其它時(shí)期酶活性較低，說(shuō)明菌絲生長(zhǎng)期和子實(shí)體發(fā)育期是大球蓋菇分解培養(yǎng)基質(zhì)、吸收營(yíng)養(yǎng)的2個(gè)主要時(shí)期;從酶活性角度看，稻草、玉米秸稈和豆秸稈培養(yǎng)基質(zhì)中酶活性較高，利用不同培養(yǎng)料栽培大球蓋菇的產(chǎn)量以及與胞外酶之間的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

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