孫楊++孫玉剛++魏國芹

摘要：為明確不同櫻桃品種對褐斑病的田間抗病能力，調(diào)查了28個(gè)櫻桃品種對褐斑病的田間抗性。結(jié)果表明，28個(gè)櫻桃品種中沒有發(fā)現(xiàn)免疫品種；共發(fā)現(xiàn)8個(gè)抗病品種，占總調(diào)查品種的28.6%；共發(fā)現(xiàn)13個(gè)較抗病品種，占總調(diào)查品種的46.4%；共發(fā)現(xiàn)5個(gè)較感病品種，占總調(diào)查品種的17.9%；共發(fā)現(xiàn)2個(gè)感病品種，占總調(diào)查品種的7.1%。

關(guān)鍵詞：櫻桃；種質(zhì)資源；褐斑??；抗性調(diào)查

中圖分類號： S436.629文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0129-02

收稿日期：2014-01-02

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng) （編號：200903019）。

作者簡介：孫楊（1983—），男，山東濟(jì)南人，研究實(shí)習(xí)員，從事櫻桃抗病育種及栽培工作。E-mail：sunyang_729@163.com。

通信作者：孫玉剛，碩士，研究員，主要從事果樹育種及栽培工作。褐斑病是櫻桃生產(chǎn)中常見的病害，主要危害葉片，造成葉片褐斑、穿孔、提早脫落，影響樹勢及第2年產(chǎn)量，發(fā)病嚴(yán)重的樹于8月葉片全部落光[1]。隨著我國櫻桃栽培面積的擴(kuò)大，褐斑病的發(fā)生呈上升趨勢[2-4]。目前我國防治櫻桃褐斑病的措施主要以噴施化學(xué)農(nóng)藥為主，雖然能減輕病害發(fā)生的概率，但容易造成環(huán)境污染，同時(shí)由于農(nóng)藥使用種類及劑量不合理，病原菌產(chǎn)生抗藥性，加大了防治難度。選育并利用抗病品種，可以減少對化學(xué)藥劑的依賴，同時(shí)增加抗病品種的選擇性。我國櫻桃抗病育種工作相對滯后，對不同櫻桃品種的抗病性未進(jìn)行全面研究。本研究通過對不同品種櫻桃田間抗病情況進(jìn)行調(diào)查，區(qū)別不同品種櫻桃的抗病性，旨在為櫻桃抗病材料的篩選提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1調(diào)查品種

櫻桃樹為位于山東省果樹研究所天平湖試驗(yàn)基地內(nèi)5年生嫁接品種，株行距為（1～2） m×4.5 m，長勢中庸，管理一般。櫻桃品種包括甜櫻桃（紅燈、意大利早紅、黑珍珠、布魯克斯、先鋒、美早、薩米脫、秦林、秦櫻、明珠、麗珠、泰珠、C1、C2、C7、C9、紅手球、桑提娜、紅蜜、早大果）、酸櫻桃（H1、H2、H3、H4、H5、H7、H8）、中國櫻桃（重慶烏皮）。

1.2方法

2013年10月13日調(diào)查發(fā)病葉片數(shù)及葉片病斑面積。每個(gè)品種在樹體的東、南、西、北每個(gè)方向選取3根枝條，調(diào)查葉片發(fā)病情況，記錄各級病葉數(shù)（表1）。病葉率、病情指數(shù)計(jì)算公式如下：

病級分級標(biāo)準(zhǔn)0無病斑1葉片病斑較少，病斑面積占整個(gè)葉面積的10%以下3病斑較多，病斑面積占整個(gè)葉面積的11%～20%5病斑較多，病斑面積占整個(gè)葉面積的21%～30%7病斑多，病斑面積占整個(gè)葉面積的31%～50%9病斑多或融合成大斑，病斑面積占整個(gè)葉面積的50%以上

相對病情指數(shù)=鑒定品種病情指數(shù)/對照品種病情指數(shù)（以病情指數(shù)最高的品種為對照品種）。

以病情指數(shù)為基礎(chǔ)，采用相對抗病性方法評價(jià)其抗病程度，根據(jù)相對抗性指數(shù)進(jìn)行抗性劃分?？剐运椒譃椋好庖撸↖）、抗?。≧）、較抗病（MR）、較感病（MS）、感病（S）。相對抗性指數(shù)：免疫為1.00，抗病為0.60～0.99，較抗病為0.40～0.59，較感病為0.20～0.39，感病為<0.20。

2結(jié)果與分析

2.1不同品種間抗病性比較

由表2可知，28個(gè)櫻桃品種的病葉率為58.0%～991%，平均為84.6%；病情指數(shù)為12.3～45.6，平均為19.8。病情指數(shù)是反映櫻桃品種抗病性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，按照病情指數(shù)、相對抗性指數(shù)的大小，可將28個(gè)品種的抗病性分為5級。由表2可知，28個(gè)櫻桃品種中沒有發(fā)現(xiàn)免疫品種；共發(fā)現(xiàn)8個(gè)抗病品種，占總調(diào)查品種的28.6%；共發(fā)現(xiàn)13個(gè)較抗病品種，占總調(diào)查品種的46.4%；共發(fā)現(xiàn)5個(gè)較感病品種，占總調(diào)查品種的17.9%；共發(fā)現(xiàn)2個(gè)感病品種，占總調(diào)查品種的7.1%。

2.2甜櫻桃品種間的抗性劃分

在調(diào)查的28個(gè)品種中，20個(gè)為甜櫻桃品種，無免疫、抗病品種，較抗病品種占多數(shù)，包括紅燈、黑珍珠、布魯克斯、先鋒、秦林、秦櫻、明珠、麗珠、C1、C9、紅蜜、早大果、泰珠；較感病品種包括美早、薩米脫、C2、C7、桑提娜；感病品種只有意大利早紅、紅手球。

2.3不同櫻桃種間抗病性比較

甜櫻桃、酸櫻桃、中國櫻桃3種櫻桃的平均病葉率分別為90.9%、67.7%、77.6%；抗病指數(shù)分別為27.1、15.8、16.4。從發(fā)病情況、抗病指數(shù)來看，酸櫻桃抗病性強(qiáng)于中國櫻桃、甜櫻桃。

3結(jié)論與討論

抗病性調(diào)查是抗病育種的基礎(chǔ)工作，能區(qū)分不同品種間相對抗性的強(qiáng)弱，為抗病育種提供理論支持。本研究表明，不同櫻桃品種對褐斑病的抗性不同，按照病情指數(shù)、相對抗性指數(shù)可分為免疫、抗病、較抗病、較感病、感病5個(gè)等級。酸櫻桃抗性最強(qiáng)，7個(gè)品種均抗??；中國櫻桃抗病性較強(qiáng)；甜櫻桃次之，意大利早紅、紅手球易感病，美早、薩米脫、桑提娜、C2、C7易感病，其余品種均為較抗病。由于調(diào)查地點(diǎn)內(nèi)中國櫻桃品種較少，因此對于中國櫻桃的抗病性還需進(jìn)一步調(diào)查。病害抗性調(diào)查是評價(jià)品種抗病性的重要指標(biāo)，也是一項(xiàng)基礎(chǔ)工作，即使是在同等發(fā)病條件下，不同年份、不同地區(qū)以及不同樹勢

表2不同櫻桃品種對褐斑病的田間抗性

會(huì)使品種間存在相對抗性差異[5]。在進(jìn)行田間抗病性評價(jià)的同時(shí)，可以進(jìn)行相應(yīng)的室內(nèi)接種試驗(yàn)，同時(shí)測定丙二醛含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量及可溶性蛋白含量等生理指標(biāo)。在實(shí)際育種中，除篩選出優(yōu)良的抗病品種、進(jìn)行種間雜交外，要進(jìn)一步找出抗病品種的抗病基因，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，培養(yǎng)抗病新品種。

參考文獻(xiàn)：

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河北省張北地區(qū)馬鈴薯瘡痂病的病菌鑒定張海穎， 郭鳳柳， 許華民， 趙偉全， 劉大群

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心，河北保定 071000）摘要：為確定河北省張北地區(qū)馬鈴薯瘡痂病的病原，從該地區(qū)瘡痂病薯病斑上分離并經(jīng)溫室盆栽接種，確定了6株病原菌菌株，結(jié)合菌株生物學(xué)特性和16S rDNA序列特征方法進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，經(jīng)16S rDNA序列聚類分析，菌株ZJK-851與Streptomyces scabies相似性為99.65%，菌株ZJK-855與S. diastatochromogenes相似性為99.15%，菌株ZJK-854、06-D、M1-2、M1-5與S. europaeiscabiei相似性分別為99.73%、99.44%、99.56%、98.50%；經(jīng)生物學(xué)測試發(fā)現(xiàn)，ZJK-851、06-D、M1-2、M1-5不能利用阿拉伯糖、果糖、木糖為單一碳源。張北地區(qū)馬鈴薯瘡痂病的病原至少有3種。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯；瘡痂?。簧飳W(xué)特征；16S rDNA序列；病菌鑒定

中圖分類號： S435.32文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0131-04

收稿日期：2013-12-19

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：30700523）；河北省高層次人才項(xiàng)目（編號：20120346）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（編號：CARS-10-P12）。

作者簡介：張海穎（1987—），女，山西呂梁人，碩士，從事植物病害生物防治研究。E-mail：taiyuanshiyuan0000@163.com。

通信作者：趙偉全，博士，教授，主要從事植物病害生物防治與分子植物病理學(xué)研究，E-mail：zhaowquan@126.com；劉大群，博士，主要從事植物病害生物防治與分子植物病理學(xué)研究。E-mail：ldq@hebau.edu.cn。張北地區(qū)是河北省馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)，目前，馬鈴薯瘡痂病在該地區(qū)種薯生產(chǎn)中發(fā)生較重，在商品薯生產(chǎn)過程中也時(shí)有發(fā)生，帶有瘡痂病的種薯會(huì)隨著調(diào)運(yùn)而加速該病傳播。感病薯塊的病斑初期表現(xiàn)為褐色斑點(diǎn)，隨著薯塊的膨大病斑不斷擴(kuò)展開裂，中央細(xì)胞木栓化，呈現(xiàn)略凸起或凹陷的近圓形痂狀斑塊，有時(shí)病斑連片形成不規(guī)則的斑塊，嚴(yán)重時(shí)整個(gè)薯塊均被侵染，病斑覆蓋整個(gè)薯塊。感病馬鈴薯由于品質(zhì)下降、商品價(jià)值降低，直接給種植者造成經(jīng)濟(jì)損失[1]。此外，由于塊莖表皮組織被破壞，易被其他病原菌侵染，使塊莖腐爛，造成更大的損失。引起馬鈴薯瘡痂病的病原種類較多，目前國外報(bào)道的病原菌主要有Streptomyces scabies、S. acidiscabies、S. aureofaciens、S. europaeiscabiei、S. luridiscabiei、S. niveiscabiei、S. puniciscabiei、S. reticuliscabiei、S. stelliscabiei、S. turgidiscabies[2-5]，并且還不斷有新的致病種被報(bào)道[6-7]。我國已發(fā)現(xiàn)存在S. scabies、S. acidiscabies、S. turgidiscabies、S. galilaeus等瘡痂病原菌，還未見對張北地區(qū)馬鈴薯瘡痂病原菌的報(bào)道。本研究采集張北地區(qū)馬鈴薯瘡痂病薯塊，分離病原菌菌株，利用生物學(xué)特征和16S rDNA序列進(jìn)行分類，以明確張北地區(qū)馬鈴薯瘡痂病的病菌種類，為防控該病提供有力依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1樣品采集2012年，在河北省張北地區(qū)采集馬鈴薯瘡痂病癥狀明顯的薯塊，分裝于潔凈塑料袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室立即進(jìn)行病原菌的分離。

1.1.2培養(yǎng)基菌株分離與純化采用燕麥瓊脂培養(yǎng)基（OMA）；測試菌株培養(yǎng)采用高氏1號培養(yǎng)基；液體菌絲培養(yǎng)采用胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基。

1.1.3主要試劑Taq酶、dNTP、T4 DNA Ligase、2×GC bufferⅡ、DL2000 DNA marker、DNA凝膠回收試劑盒、pGEM-T Easy 載體等均為TaKaRa公司產(chǎn)品；大腸桿菌DH 5α感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司；溶菌酶為Sigma公司產(chǎn)品；TSB、TRYPTONE和YEAST EXTRACT為Bacto公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2菌株的分離純化與孢懸液的制備

參照劉大群等的方法[8]，將病薯用蒸餾水洗凈，用解剖刀切取約5 mm3病健交界處的薯塊，于0.3% NaClO溶液中浸泡約30 s；取出切成1 mm厚的小片，置于1.8%瓊脂培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d；挑取單菌落劃線于含1 mg/L Penicillin G 的OMA培養(yǎng)基進(jìn)行純化，連續(xù)純化3次后，即得純鏈霉菌菌株。

挑取生長6 d的單菌落孢子，涂布于高氏1號培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d，用無菌水洗下孢子倒入離心管中，置于渦旋振蕩器上振蕩1 min；經(jīng)裝有脫脂棉的注射器過濾后，轉(zhuǎn)移至離心管中4 ℃ 10 000 g離心15 min，棄上清，加入無菌20%甘油，充分混勻后-20 ℃保存。

1.3菌株致病性檢測

選用健康的馬鈴薯品種Favorita薯塊，用清水洗凈，表面用75%乙醇消毒，置于28 ℃光照培養(yǎng)箱中催芽；待芽長約 1 cm 時(shí)取出切塊，每塊留1個(gè)芽眼；待薯塊切口愈合后，播種至蛭石和土壤以1 ∶1比例混配、直徑約15 cm的花盆中，待薯苗高約10 cm時(shí)，選取長勢一致的植株進(jìn)行接種試驗(yàn)。將高氏1號培養(yǎng)基上生長10 d的待測菌株孢子用無菌水洗下，調(diào)整孢子懸浮液濃度至106 CFU/mL，采用灌根法接種，接種量為每盆200 mL，設(shè)清水處理對照。每處理重復(fù)3次，待馬鈴薯收獲后檢測瘡痂病發(fā)病情況。

1.4病原菌生物學(xué)特性測定

菌株碳源、氮源利用及敏感性測試等參照Lambert等的方法[9-10]，其他鑒定指標(biāo)測定參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。

1.5病原菌16S rDNA序列分析

各菌株菌絲培養(yǎng)和基因組的提取參照《Practical Streptomyces Genetics》中的方法[12]進(jìn)行，并置于-20 ℃冰箱中保存待用。

1.5.116S rDNA 序列擴(kuò)增和測序根據(jù)NCBI GenBank已報(bào)道的鏈霉菌16S rDNA序列設(shè)計(jì)引物，由華大基因科技有限公司進(jìn)行合成，引物序列為P（u）：5′-CATTCACGGAGAGTTTGATCC-3′，P（d）：5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′。PCR擴(kuò)增體系為：ddH2O 20.2 μL、2×GC buffer Ⅱ 25 μL、10 mmol/L dNTP 1 μL、引物P（u） 1 μL、引物P（d） 1 μL、DNA模板1 μL、Taq DNA聚合酶0.8 μL，總體積為50 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，62 ℃ 退火50 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用DNA凝膠回收試劑盒回收，擴(kuò)增產(chǎn)物與pGM-T載體連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH 5α，挑取陽性克隆送交華大基因進(jìn)行測序。

1.5.2系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建對測試菌株16S rDNA序列校對，在GenBank中進(jìn)行Blast比對，選取同源性較高的登記菌株16S rDNA序列作為參比序列，利用MEGA 5.0軟件進(jìn)行多重序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2結(jié)果與分析

2.1菌株致病性驗(yàn)證

采集的病薯經(jīng)分離純化后，共獲得6株鏈霉菌菌株。溫室盆栽接種試驗(yàn)結(jié)果表明，所得6個(gè)菌株均能使馬鈴薯新生薯塊產(chǎn)生褐色壞死，其中，ZJK-851、ZJK-855菌株的病斑最為典型，呈現(xiàn)略凸起的較大痂狀病斑，ZJK-854、06-D、M1-2、M1-5菌株造成的病斑相對較?。▓D1）。

2.2菌株生物學(xué)特征

6個(gè)測試菌株在高氏1號培養(yǎng)基上形態(tài)特征由表1可見：6株菌株的孢子絲呈螺旋狀；菌株ZJK-851、ZJK-854、06-D、M1-2、M1-5孢子呈灰色，菌株ZJK-855孢子為灰白色。ZJK-854、06-D、M1-2、M1-5產(chǎn)生褐色可溶性色素，ZJK-851、ZJK-855產(chǎn)生黃色可溶性色素。

6個(gè)菌株生理生化特征測試結(jié)果表明（表1）：ZJK-851、06-D、M1-2，M1-5不能以阿拉伯糖、木糖、果糖為單一碳源，只有ZJK-855能以阿拉伯糖、木糖、果糖為單一碳源；在被測的甲硫氨酸、羥脯氨酸和組氨酸中，6種菌株均能以這3種氨基酸作為單一氮源；在敏感性測試中，6個(gè)菌株對 20 μg/mL 鏈霉素和0.5 μg/mL結(jié)晶紫均敏感，對10 IU/mL青霉素都不敏感，ZJK-855對0.1%苯酚不敏感，其余5種菌株對苯酚均敏感；6種菌株在pH值為5.0時(shí)能生長；ZJK-855不產(chǎn)生黑色素，其余5種菌株均產(chǎn)生黑色素，6種菌都不產(chǎn)生可溶性色素。

2.316S rDNA擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

采用《鏈霉菌操作手冊》中的方法提取各菌株的基因組DNA，利用P（u）和P（d）引物對菌株基因組進(jìn)行擴(kuò)增，均能擴(kuò)出約1.5 kb的目的片段（圖2）。將條帶分別回收、純化，交由華大基因測序，序列經(jīng)校對，在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast分析，結(jié)果表明，6個(gè)菌株測得的序列均為鏈霉菌16S rDNA序列。選取與測試菌株序列相似性較高的菌株作為參比菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，選取的參比菌株為S. acidiscabies（AY621376）、S. bobili（NR_041121）、S. europaeiscabiei（NR_042790）、S. galilaeus（NR_040857）、S. griseus（NR_074787）、S. scabiei ATCC49173（D63862）、S. setonii（D63872）、S. turgidiscabies（NR_040828）、S. diastatochromogenes ATCC12309（AB026218）、S. lividans TK24、S. albulus（AB024443）、S. galbus（NR_026178）、S. chartreuses（NR_041216）、S. virginiae（JN201950）。利用MEGA 5.0軟件對所有菌株的16SrDNA序列進(jìn)行聚類分析，采用鄰接法（Neighbor-表16個(gè)菌株的生理生化特性

菌株生物學(xué)特征碳源利用孢子鏈形態(tài)孢子堆顏色阿拉伯糖棉籽糖甘露醇木糖果糖鼠李糖葡萄糖蔗糖肌醇ZJK-851SG-++--++++ZJK-854SG-++++++++ZJK-855SGW+++++++++06-DSG-++--++++M1-2SG-++--++++M1-5SG-++--++++S. scabiesSG-++--++++S. galilaeusSG-+---++++S. acidiscabiesRfW-++--++++S. turgidiscabiesRfW-+----+++菌株氮源利用敏感性測定甲硫氨酸羥脯氨酸組氨酸10 IU/mL

青霉素0.1%苯酚20 μg/mL

鏈霉素0.5 μg/mL

結(jié)晶紫最低生長

pH值可溶性

色素黑色素

產(chǎn)生JK-851++++---5-+ZJK-854++++---5-+ZJK-855+++++--5--06-D++++---5-+M1-2++++---5-+M1-5++++---5-+S. scabies++++---5-+S. galilaeus++++---5--S. acidiscabies++++---4Y-S. turgidiscabies-+++---5.5--注：+：產(chǎn)生或能生長，-：不產(chǎn)生或不能生長；S：螺旋狀；Rf：直-柔曲狀；G：灰色；W：白色；Y：黃色。

Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，菌株ZJK-851與S. scabies ATCC 49173最為相近，相似性為99.65%；菌株ZJK-855與S. diastatochromogenes較為相近，相似性為9915%；菌株ZJK-854、06-D、M1-2、M1-5聚為1支，與S. europaeiscabiei親緣關(guān)系最近，相似性分別為99.73%、9944%、9956%、98.50%（圖3）。

3討論

馬鈴薯瘡痂病為土傳病害，是近年來馬鈴薯生產(chǎn)上發(fā)生和蔓延較快的病害之一，主要通過土壤和種薯在馬鈴薯種薯運(yùn)輸過程中傳播至新的地區(qū)。目前，馬鈴薯種薯流通主要受市場經(jīng)濟(jì)調(diào)節(jié)，流向無明顯規(guī)律，這是瘡痂病分布復(fù)雜的原因之一。另外，目前世界上已知瘡痂病可由10多種植物病原鏈霉菌引起，造成的癥狀復(fù)雜多樣[13]，這也是導(dǎo)致該病害復(fù)雜的原因。我國馬鈴薯瘡痂病菌的組成也較為多樣，存在S. scabies、S. galilaeus、S. bobili、S. turgidiscabies、S. acidiscabies等多種病原菌[2，9]。康蓉等曾對甘肅馬鈴薯瘡痂病病原進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)甘肅省馬鈴薯瘡痂病的病原有S. scabies和S. griseus[14]。因此，只有明確當(dāng)?shù)丿忦璨〔≡姆N類和組成，才能有針對性地采取防控措施。

在病原菌鑒定過程中，各生物學(xué)性狀可能會(huì)出現(xiàn)少量指標(biāo)與文獻(xiàn)報(bào)道不一致，因此，應(yīng)選擇盡可能多的生物學(xué)測試指標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)分析。目前，核酸數(shù)據(jù)庫中細(xì)菌16S rDNA序列的數(shù)據(jù)信息日益完善，已成為細(xì)菌鑒定的重要參考依據(jù)。鏈霉菌在鑒定時(shí)，16S rDNA序列是非常有力的依據(jù)，根據(jù)16S rDNA序列就能將菌株進(jìn)行初步鑒定。本研究結(jié)合各菌株的生物學(xué)特征和16S rDNA序列特點(diǎn)，對河北省張北地區(qū)的6株瘡痂病原菌進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)利用16S rDNA序列可與S. scabies、S. europaeiscabiei和S. diastatochromogenes分別聚類，說明張北地區(qū)的馬鈴薯瘡痂病菌至少有3種。在生理生化測定中，菌株ZJK-851、06-D、M1-2、M1-5不能利用阿拉伯糖、果糖、木糖，與國際已報(bào)道的S. scabies、S. europaeiscabiei能利用這3種糖結(jié)果不一致，但是與中國參照菌株S. scabies結(jié)果相一致；菌株ZJK-855與S. diastatochromogenes不能利用木糖、阿拉伯糖的研究結(jié)果不一致，其原因可能與菌株地區(qū)適應(yīng)性和自身特性有關(guān)。

本研究分析的病原菌數(shù)量有限，所得結(jié)果只能作為該地區(qū)病原的初步結(jié)論，將繼續(xù)對張北地區(qū)進(jìn)行全面調(diào)查，獲得更多菌株進(jìn)行系統(tǒng)分析鑒定，為該地區(qū)馬鈴薯瘡痂病的防治提供準(zhǔn)確信息。

參考文獻(xiàn)：

[1]趙偉全，楊文香，李亞寧，等. 中國馬鈴薯瘡痂病菌的鑒定[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39（2）：313-318.

[2]Loria R，Bukhalid R A，F(xiàn)ry B A，et al. Plant pathogenicity in the genus Streptomyces[J]. Plant Disease，1997，81（8）：836-846.

[3]Wanner L A. A survey of genetic variation in Streptomyces isolates causing potato common scab in the United States[J]. Phytopathology，2006，96（12）：1363-1371.

[4]Park D H，Yu Y M，Kim J S，et al. Characterization of Streptomyces causing potato common scab in Korea[J]. Plant Disease，2003，87（11）：1290-1296.

[5]Kreuze J F，Suomalainen S，Paulin L，et al. Phylogenetic analysis of 16S rRNA genes and PCR analysis of the nec1 gene from Streptomyces spp.causing common scab，pitted scab，and netted scab in Finland[J]. Phytopathology，1999，89（6）：462-469.

[6]Groth I，Schütze B，Boettcher T，et al. Kitasatospora putterlickiae sp. nov.，isolated from rhizosphere soil，transfer of Streptomyces kifunensis to the genus Kitasatospora as Kitasatospora kifunensis comb. nov.，and emended description of Streptomyces aureofaciens Duggar 1948[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2003，53（Pt 6）：2033-2040.

[7]Wanner L A. A new strain of Streptomyces causing common scab in potato[J]. Plant Disease，2007，91（4）：352-359.

[8]Liu D Q. Biological control of Streptomyces scabies and other plant pathogens[D]. Minnesota：University of Minnesota，1992.

[9]Lambert D H，Loria R. Streptomyces scabies sp.Nov.，nom.Rev[J]. International Journal of Systematic Bacteriology，1989，39（4）：387-392.

[10]Miyajima K，Tanaka F，Takeuchi T，et al. Streptomyces turgidiscabies sp. nov.[J]. International Journal of Systematic Bacteriology，1998，48（2）：495-502.

[11]中國科學(xué)院微生物研究所伯杰細(xì)菌鑒定手冊翻譯組.伯杰細(xì)菌鑒定手冊[M]. 8版.北京：科學(xué)出版社，1984.

[12]Kieser T，Bibb M J，Buttner M J，et al. Practical Streptomyces genetics[M]. England：John Innes Foundation，2000.

[13]Loria R，Kers J，Joshi M. Evolution of plant pathogenicity in Streptomyces[J]. Annual Review of Phytopathology，2006，44：469-487.

[14]康蓉，王生榮. 甘肅馬鈴薯瘡痂病病原初步鑒定[J]. 植物保護(hù)，2013，39（3）：78-82.

青霉素0.1%苯酚20 μg/mL

鏈霉素0.5 μg/mL

結(jié)晶紫最低生長

pH值可溶性

色素黑色素

產(chǎn)生JK-851++++---5-+ZJK-854++++---5-+ZJK-855+++++--5--06-D++++---5-+M1-2++++---5-+M1-5++++---5-+S. scabies++++---5-+S. galilaeus++++---5--S. acidiscabies++++---4Y-S. turgidiscabies-+++---5.5--注：+：產(chǎn)生或能生長，-：不產(chǎn)生或不能生長；S：螺旋狀；Rf：直-柔曲狀；G：灰色；W：白色；Y：黃色。

Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，菌株ZJK-851與S. scabies ATCC 49173最為相近，相似性為99.65%；菌株ZJK-855與S. diastatochromogenes較為相近，相似性為9915%；菌株ZJK-854、06-D、M1-2、M1-5聚為1支，與S. europaeiscabiei親緣關(guān)系最近，相似性分別為99.73%、9944%、9956%、98.50%（圖3）。

3討論

馬鈴薯瘡痂病為土傳病害，是近年來馬鈴薯生產(chǎn)上發(fā)生和蔓延較快的病害之一，主要通過土壤和種薯在馬鈴薯種薯運(yùn)輸過程中傳播至新的地區(qū)。目前，馬鈴薯種薯流通主要受市場經(jīng)濟(jì)調(diào)節(jié)，流向無明顯規(guī)律，這是瘡痂病分布復(fù)雜的原因之一。另外，目前世界上已知瘡痂病可由10多種植物病原鏈霉菌引起，造成的癥狀復(fù)雜多樣[13]，這也是導(dǎo)致該病害復(fù)雜的原因。我國馬鈴薯瘡痂病菌的組成也較為多樣，存在S. scabies、S. galilaeus、S. bobili、S. turgidiscabies、S. acidiscabies等多種病原菌[2，9]。康蓉等曾對甘肅馬鈴薯瘡痂病病原進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)甘肅省馬鈴薯瘡痂病的病原有S. scabies和S. griseus[14]。因此，只有明確當(dāng)?shù)丿忦璨〔≡姆N類和組成，才能有針對性地采取防控措施。

在病原菌鑒定過程中，各生物學(xué)性狀可能會(huì)出現(xiàn)少量指標(biāo)與文獻(xiàn)報(bào)道不一致，因此，應(yīng)選擇盡可能多的生物學(xué)測試指標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)分析。目前，核酸數(shù)據(jù)庫中細(xì)菌16S rDNA序列的數(shù)據(jù)信息日益完善，已成為細(xì)菌鑒定的重要參考依據(jù)。鏈霉菌在鑒定時(shí)，16S rDNA序列是非常有力的依據(jù)，根據(jù)16S rDNA序列就能將菌株進(jìn)行初步鑒定。本研究結(jié)合各菌株的生物學(xué)特征和16S rDNA序列特點(diǎn)，對河北省張北地區(qū)的6株瘡痂病原菌進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)利用16S rDNA序列可與S. scabies、S. europaeiscabiei和S. diastatochromogenes分別聚類，說明張北地區(qū)的馬鈴薯瘡痂病菌至少有3種。在生理生化測定中，菌株ZJK-851、06-D、M1-2、M1-5不能利用阿拉伯糖、果糖、木糖，與國際已報(bào)道的S. scabies、S. europaeiscabiei能利用這3種糖結(jié)果不一致，但是與中國參照菌株S. scabies結(jié)果相一致；菌株ZJK-855與S. diastatochromogenes不能利用木糖、阿拉伯糖的研究結(jié)果不一致，其原因可能與菌株地區(qū)適應(yīng)性和自身特性有關(guān)。

本研究分析的病原菌數(shù)量有限，所得結(jié)果只能作為該地區(qū)病原的初步結(jié)論，將繼續(xù)對張北地區(qū)進(jìn)行全面調(diào)查，獲得更多菌株進(jìn)行系統(tǒng)分析鑒定，為該地區(qū)馬鈴薯瘡痂病的防治提供準(zhǔn)確信息。

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[6]Groth I，Schütze B，Boettcher T，et al. Kitasatospora putterlickiae sp. nov.，isolated from rhizosphere soil，transfer of Streptomyces kifunensis to the genus Kitasatospora as Kitasatospora kifunensis comb. nov.，and emended description of Streptomyces aureofaciens Duggar 1948[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2003，53（Pt 6）：2033-2040.

[7]Wanner L A. A new strain of Streptomyces causing common scab in potato[J]. Plant Disease，2007，91（4）：352-359.

[8]Liu D Q. Biological control of Streptomyces scabies and other plant pathogens[D]. Minnesota：University of Minnesota，1992.

[9]Lambert D H，Loria R. Streptomyces scabies sp.Nov.，nom.Rev[J]. International Journal of Systematic Bacteriology，1989，39（4）：387-392.

[10]Miyajima K，Tanaka F，Takeuchi T，et al. Streptomyces turgidiscabies sp. nov.[J]. International Journal of Systematic Bacteriology，1998，48（2）：495-502.

[11]中國科學(xué)院微生物研究所伯杰細(xì)菌鑒定手冊翻譯組.伯杰細(xì)菌鑒定手冊[M]. 8版.北京：科學(xué)出版社，1984.

[12]Kieser T，Bibb M J，Buttner M J，et al. Practical Streptomyces genetics[M]. England：John Innes Foundation，2000.

[13]Loria R，Kers J，Joshi M. Evolution of plant pathogenicity in Streptomyces[J]. Annual Review of Phytopathology，2006，44：469-487.

[14]康蓉，王生榮. 甘肅馬鈴薯瘡痂病病原初步鑒定[J]. 植物保護(hù)，2013，39（3）：78-82.

青霉素0.1%苯酚20 μg/mL

鏈霉素0.5 μg/mL

結(jié)晶紫最低生長

pH值可溶性

色素黑色素

產(chǎn)生JK-851++++---5-+ZJK-854++++---5-+ZJK-855+++++--5--06-D++++---5-+M1-2++++---5-+M1-5++++---5-+S. scabies++++---5-+S. galilaeus++++---5--S. acidiscabies++++---4Y-S. turgidiscabies-+++---5.5--注：+：產(chǎn)生或能生長，-：不產(chǎn)生或不能生長；S：螺旋狀；Rf：直-柔曲狀；G：灰色；W：白色；Y：黃色。

Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，菌株ZJK-851與S. scabies ATCC 49173最為相近，相似性為99.65%；菌株ZJK-855與S. diastatochromogenes較為相近，相似性為9915%；菌株ZJK-854、06-D、M1-2、M1-5聚為1支，與S. europaeiscabiei親緣關(guān)系最近，相似性分別為99.73%、9944%、9956%、98.50%（圖3）。

3討論

馬鈴薯瘡痂病為土傳病害，是近年來馬鈴薯生產(chǎn)上發(fā)生和蔓延較快的病害之一，主要通過土壤和種薯在馬鈴薯種薯運(yùn)輸過程中傳播至新的地區(qū)。目前，馬鈴薯種薯流通主要受市場經(jīng)濟(jì)調(diào)節(jié)，流向無明顯規(guī)律，這是瘡痂病分布復(fù)雜的原因之一。另外，目前世界上已知瘡痂病可由10多種植物病原鏈霉菌引起，造成的癥狀復(fù)雜多樣[13]，這也是導(dǎo)致該病害復(fù)雜的原因。我國馬鈴薯瘡痂病菌的組成也較為多樣，存在S. scabies、S. galilaeus、S. bobili、S. turgidiscabies、S. acidiscabies等多種病原菌[2，9]?？等氐仍鴮Ω拭C馬鈴薯瘡痂病病原進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)甘肅省馬鈴薯瘡痂病的病原有S. scabies和S. griseus[14]。因此，只有明確當(dāng)?shù)丿忦璨〔≡姆N類和組成，才能有針對性地采取防控措施。

在病原菌鑒定過程中，各生物學(xué)性狀可能會(huì)出現(xiàn)少量指標(biāo)與文獻(xiàn)報(bào)道不一致，因此，應(yīng)選擇盡可能多的生物學(xué)測試指標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)分析。目前，核酸數(shù)據(jù)庫中細(xì)菌16S rDNA序列的數(shù)據(jù)信息日益完善，已成為細(xì)菌鑒定的重要參考依據(jù)。鏈霉菌在鑒定時(shí)，16S rDNA序列是非常有力的依據(jù)，根據(jù)16S rDNA序列就能將菌株進(jìn)行初步鑒定。本研究結(jié)合各菌株的生物學(xué)特征和16S rDNA序列特點(diǎn)，對河北省張北地區(qū)的6株瘡痂病原菌進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)利用16S rDNA序列可與S. scabies、S. europaeiscabiei和S. diastatochromogenes分別聚類，說明張北地區(qū)的馬鈴薯瘡痂病菌至少有3種。在生理生化測定中，菌株ZJK-851、06-D、M1-2、M1-5不能利用阿拉伯糖、果糖、木糖，與國際已報(bào)道的S. scabies、S. europaeiscabiei能利用這3種糖結(jié)果不一致，但是與中國參照菌株S. scabies結(jié)果相一致；菌株ZJK-855與S. diastatochromogenes不能利用木糖、阿拉伯糖的研究結(jié)果不一致，其原因可能與菌株地區(qū)適應(yīng)性和自身特性有關(guān)。

本研究分析的病原菌數(shù)量有限，所得結(jié)果只能作為該地區(qū)病原的初步結(jié)論，將繼續(xù)對張北地區(qū)進(jìn)行全面調(diào)查，獲得更多菌株進(jìn)行系統(tǒng)分析鑒定，為該地區(qū)馬鈴薯瘡痂病的防治提供準(zhǔn)確信息。

參考文獻(xiàn)：

[1]趙偉全，楊文香，李亞寧，等. 中國馬鈴薯瘡痂病菌的鑒定[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39（2）：313-318.

[2]Loria R，Bukhalid R A，F(xiàn)ry B A，et al. Plant pathogenicity in the genus Streptomyces[J]. Plant Disease，1997，81（8）：836-846.

[3]Wanner L A. A survey of genetic variation in Streptomyces isolates causing potato common scab in the United States[J]. Phytopathology，2006，96（12）：1363-1371.

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[5]Kreuze J F，Suomalainen S，Paulin L，et al. Phylogenetic analysis of 16S rRNA genes and PCR analysis of the nec1 gene from Streptomyces spp.causing common scab，pitted scab，and netted scab in Finland[J]. Phytopathology，1999，89（6）：462-469.

[6]Groth I，Schütze B，Boettcher T，et al. Kitasatospora putterlickiae sp. nov.，isolated from rhizosphere soil，transfer of Streptomyces kifunensis to the genus Kitasatospora as Kitasatospora kifunensis comb. nov.，and emended description of Streptomyces aureofaciens Duggar 1948[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2003，53（Pt 6）：2033-2040.

[7]Wanner L A. A new strain of Streptomyces causing common scab in potato[J]. Plant Disease，2007，91（4）：352-359.

[8]Liu D Q. Biological control of Streptomyces scabies and other plant pathogens[D]. Minnesota：University of Minnesota，1992.

[9]Lambert D H，Loria R. Streptomyces scabies sp.Nov.，nom.Rev[J]. International Journal of Systematic Bacteriology，1989，39（4）：387-392.

[10]Miyajima K，Tanaka F，Takeuchi T，et al. Streptomyces turgidiscabies sp. nov.[J]. International Journal of Systematic Bacteriology，1998，48（2）：495-502.

[11]中國科學(xué)院微生物研究所伯杰細(xì)菌鑒定手冊翻譯組.伯杰細(xì)菌鑒定手冊[M]. 8版.北京：科學(xué)出版社，1984.

[12]Kieser T，Bibb M J，Buttner M J，et al. Practical Streptomyces genetics[M]. England：John Innes Foundation，2000.

[13]Loria R，Kers J，Joshi M. Evolution of plant pathogenicity in Streptomyces[J]. Annual Review of Phytopathology，2006，44：469-487.

[14]康蓉，王生榮. 甘肅馬鈴薯瘡痂病病原初步鑒定[J]. 植物保護(hù)，2013，39（3）：78-82.