李孝凱等

摘要：研究低溫脅迫對(duì)毛尖紫萼蘚、東亞砂蘚生理生化特性，以及解除脅迫后生理生化和光合特性的影響。結(jié)果表明，低溫脅迫下，2種蘚游離脯氨酸、可溶性糖含量顯著上升；-20 ℃處理下，2種蘚可溶性蛋白含量顯著下降，其他低溫脅迫下可溶性蛋白含量顯著上升；解除脅迫后，隨恢復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)，2種蘚可溶性糖、可溶性蛋白含量顯著高于對(duì)照，實(shí)際光化學(xué)量子產(chǎn)額、電子傳遞效率顯著上升，非光化學(xué)淬滅系數(shù)顯著下降；低溫脅迫下，2種蘚能通過(guò)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累來(lái)提高植物抗逆性從而適應(yīng)低溫；在解除脅迫恢復(fù)過(guò)程中，2種蘚類(lèi)植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及光合特性能夠迅速恢復(fù)到正常生長(zhǎng)狀態(tài)，說(shuō)明極端低溫并沒(méi)有對(duì)2種蘚造成不可恢復(fù)的傷害，2種蘚類(lèi)植物均能夠適應(yīng)極端低溫。

關(guān)鍵詞：毛尖紫萼蘚；東亞砂蘚；低溫脅迫；滲透調(diào)節(jié)；光合特性

中圖分類(lèi)號(hào)： Q945.78文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）10-0355-04

收稿日期：2013-11-14

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31070180、31270254）。

作者簡(jiǎn)介：李孝凱（1986—）， 男，黑龍江佳木斯人，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参镞z傳學(xué)。E-mail：075lxk@163.com。

通信作者：沙偉，教授，研究方向?yàn)樘μ\植物分子生物學(xué)和遺傳學(xué)。E-mail：shw1129@263.net。春旱、秋霜凍為我國(guó)北方地區(qū)的主要自然災(zāi)害，這些災(zāi)害對(duì)植物生長(zhǎng)、產(chǎn)量、分布起決定性作用，因此低溫已成為限制植物地理分布和植物產(chǎn)量的重要環(huán)境因素之一。植物抗寒性研究表明，低溫環(huán)境下植物的生理生化和光合特性最先受到影響，植物在適應(yīng)低溫的過(guò)程中會(huì)積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和調(diào)節(jié)光合特性[1]。植物生理生化及光合特性通常被作為衡量植物抗寒性的重要指標(biāo)，因此研究低溫對(duì)植物生理生化及光合特性影響具有重要意義。苔蘚植物隸屬于高等植物中較為低等的類(lèi)群，是自然界的拓荒者之一，是種數(shù)僅次于種子植物的高等植物，全世界約有23 000多種苔蘚植物，我國(guó)已發(fā)現(xiàn) 2 200多種，占全世界的9.1%[2]。在中國(guó)，從年均氣溫低于 0 ℃ 的極地到年均氣溫超過(guò)53 ℃的溫泉都有苔蘚植物分布，由此可見(jiàn)，苔蘚植物在我國(guó)分布范圍極其廣泛，由于很多種類(lèi)的苔蘚植物能夠在極度低溫和陽(yáng)光直射的逆境環(huán)境下正常生長(zhǎng)，甚至寒溫帶仍有苔蘚植物生長(zhǎng)，很多種類(lèi)的苔蘚植物往往被作為抗寒性研究材料[3]。黑龍江省五大連池風(fēng)景區(qū)冬季嚴(yán)寒漫長(zhǎng)，夏季涼爽短暫，年均氣溫-0.5 ℃，最低氣溫為-42 ℃，毛尖紫萼蘚（Grimmia pilifera）、東亞砂蘚（Racomitrium japonicum）2種蘚類(lèi)植物在該條件下均能夠正常生長(zhǎng)，因此其抗寒機(jī)制具有重要探索價(jià)值。目前，植物抗寒性相關(guān)報(bào)道很多，但鮮有這2種蘚抗寒性相關(guān)研究。因此，本研究通過(guò)人工模擬低溫條件，從滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及光合特性等方面綜合分析2種蘚類(lèi)植物的抗寒機(jī)制，旨在為苔蘚植物抗寒性研究提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

將采自黑龍江省五大連池風(fēng)景區(qū)的已干燥毛尖紫萼蘚、東亞砂蘚清洗干凈，自然復(fù)水，25 ℃培養(yǎng)至材料達(dá)到自然生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.2處理

將正常生長(zhǎng)的植物分別放在-80、-40、-20、4 ℃冰箱中進(jìn)行低溫脅迫，脅迫時(shí)間分別為5、10、15、20、25、30 d，取其莖尖部分，每個(gè)處理3次重復(fù)，測(cè)定相應(yīng)生理指標(biāo)。將不同溫度脅迫30 d后的2種蘚分別進(jìn)行解凍恢復(fù)5 d（R）處理，分別測(cè)定其生理指標(biāo)及恢復(fù)過(guò)程中的光合特性變化，以25 ℃正常生長(zhǎng)植物作為對(duì)照（CK）。

1.3方法

1.3.1生理指標(biāo)測(cè)定脯氨酸含量的測(cè)定采用磺基水楊酸法[4]；可溶性糖含量的測(cè)定采用蒽酮法[4]；可溶性蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán) G250染色法[4]。

1.3.2光合指標(biāo)測(cè)定采用美國(guó)Li-COR公司生產(chǎn)的 Li-6400 便攜式光合系統(tǒng)分析儀于08：00測(cè)定2種蘚的實(shí)際光化學(xué)量子產(chǎn)額

2結(jié)果與分析

2.1低溫脅迫下毛尖紫萼蘚、東亞砂蘚脯氨酸含量的變化

植物體內(nèi)脯氨酸作為最重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，在外界環(huán)境因子（如干旱、高鹽、高溫、低溫等）脅迫時(shí)，脯氨酸含量均會(huì)升高，并積累在植物器官里[5-6]。由圖1可以看出，-80～4 ℃脅迫30 d后2種蘚脯氨酸含量極顯著高于對(duì)照（P<0.01），-80、-40、-20、4 ℃處理下，毛尖紫萼蘚脯氨酸含量分別是對(duì)照的288%、188%、195%、154%，東亞砂蘚脯氨酸含量分別是對(duì)照的419%、326%、292%、230%。隨著脅迫溫度下降，2種蘚脯氨酸含量急劇上升，并且東亞砂蘚脯氨酸含量增幅較毛尖紫萼蘚更大。2種蘚解除脅迫恢復(fù) 5 d 后脯氨酸含量下降，此時(shí)其含量仍顯著高于對(duì)照（P<005）。

2.2低溫脅迫下毛尖紫萼蘚、東亞砂蘚可溶性糖含量變化

由圖2可以看出，4、-20、-80 ℃脅迫下，毛尖紫萼蘚、東亞砂蘚可溶性糖含量極顯著上升（P<0.01），脅迫30 d后，毛尖紫萼蘚可溶性糖含量分別是對(duì)照的118%、107%、153%，東亞砂蘚可溶性糖含量分別是對(duì)照的116%、141%、145%。-40 ℃脅迫下，2種蘚可溶性糖含量與對(duì)照差異不顯著，可能是該溫度能夠激發(fā)2種蘚其他滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，與可溶性糖產(chǎn)生協(xié)同作用抵御寒冷，使得該溫度下2種蘚可溶性糖含量與對(duì)照差異不顯著。2種蘚在解除脅迫恢復(fù)過(guò)程中可溶性糖含量與對(duì)照差異不顯著。

2.3低溫脅迫下毛尖紫萼蘚、東亞砂蘚可溶性蛋白含量變化

由圖3可以看出，低溫脅迫下，毛尖紫萼蘚、東亞砂蘚可溶性蛋白含量顯著上升（P<0.05）。4、-40、-80 ℃脅迫 30 d 后，毛尖紫萼蘚可溶性蛋白含量分別是對(duì)照的198%、107%、117%，東亞砂蘚可溶性蛋白含量分別是對(duì)照的122%、103%、105%。-20 ℃脅迫30 d后，2種蘚可溶性蛋白含量顯著極低于對(duì)照（P<0.01），毛尖紫萼蘚、東亞砂蘚可溶性蛋白含量分別是對(duì)照的42%、47%，說(shuō)明該溫度下2種蘚可溶性蛋白大量降解。解除脅迫恢復(fù)后，2種蘚可溶性蛋白含量顯著高于對(duì)照（P<0.05）。

2.4低溫復(fù)蘇下毛尖紫萼蘚、東亞砂蘚實(shí)際光化學(xué)量子產(chǎn)額變化

正常生長(zhǎng)植物在光合作用下PSⅡ總的光化學(xué)量子產(chǎn)額

慢上升，說(shuō)明恢復(fù)過(guò)程中其光能轉(zhuǎn)換能力逐漸提高。

2.5低溫復(fù)蘇下毛尖紫萼蘚、東亞砂蘚電子傳遞速率（ETR）變化

植物進(jìn)行光合作用時(shí)其光合機(jī)構(gòu)吸收光能，電荷分離產(chǎn)生的電子會(huì)沿著電子傳遞鏈向下傳遞，電子傳遞速率能夠反映 PSⅡ 反應(yīng)中心的電子捕獲效率[8]。由圖5可以看出，解除低溫脅迫后毛尖紫萼蘚、東亞砂蘚ETR與Yield變化規(guī)律基本一致，都隨脅迫處理時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸上升趨勢(shì)，各處理間差異顯著（P<0.05）。-80、-40、-20、4 ℃處理下，解除脅迫于室溫25 ℃下恢復(fù)4 d后毛尖紫萼蘚ETR分別是對(duì)照的106%、106%、102%、108%；東亞砂蘚ETR分別是對(duì)照的117%、118%、111%、117%。表明2種植物PSⅡ 反應(yīng)中心的電子捕獲效率在恢復(fù)過(guò)程中逐漸提高。

2.6低溫復(fù)蘇下毛尖紫萼蘚、東亞砂蘚非光化學(xué)淬滅系數(shù)（qN）變化

qN反映植物天然色素在光合作用下吸收的光能不能用于光合電子傳遞而以熱形式耗散掉的部分光能，是PSⅡ 中重要的保護(hù)機(jī)制[9]。由圖6可以看出，解除低溫脅迫后毛尖紫萼蘚、東亞砂蘚qN顯著下降，各處理間差異顯著（P<005）。-80、-40、-20、4 ℃處理下，解除脅迫于室溫25 ℃下恢復(fù)4 d后毛尖紫萼蘚qN分別為對(duì)照的0.96%、0.41%、038%、0.90%；東亞砂蘚qN分別是對(duì)照的0.26%、0.34%、091%、0.89%。說(shuō)明2種蘚隨PSⅡ 中ETR的提高，能將更多吸收的光用于光合作用，使qN逐漸下降。

3結(jié)論與討論

脯氨酸是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，在低溫環(huán)境下能提高胞內(nèi)溶質(zhì)濃度，降低細(xì)胞冰點(diǎn)，防止細(xì)胞過(guò)度脫水，降低低溫對(duì)植物細(xì)胞造成的損傷。大量研究表明，脯氨酸與植物的抗寒性有一定相關(guān)性，且脯氨酸還是活性氧的清除

劑，能保護(hù)膜結(jié)構(gòu)，防止膜脂過(guò)氧化[10-12]。本研究表明，2種蘚在不同溫度脅迫下脯氨酸含量變化規(guī)律基本一致，隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，其含量呈急劇上升趨勢(shì)，可見(jiàn)隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，2種蘚能夠誘導(dǎo)脯氨酸合成，這可以說(shuō)明脯氨酸參與了2種蘚的生理代謝和能量代謝，其含量增加正是2種蘚應(yīng)對(duì)低溫的生理響應(yīng)。在低溫脅迫的15 d內(nèi)，2種蘚類(lèi)植物脯氨酸含量出現(xiàn)了一些波動(dòng)，這和一般植物在低溫脅迫過(guò)程中的變化規(guī)律基本相似，說(shuō)明在脅迫初期脯氨酸積極參與調(diào)節(jié)植物細(xì)胞之間滲透壓平衡，防止細(xì)胞過(guò)度失水，減少低溫對(duì)植物體的傷害，這與史玉煒等的研究結(jié)果[10]一致。脅迫后期，毛尖紫萼蘚脯氨酸含量略有下降，但整個(gè)脅迫過(guò)程其含量均顯著高于對(duì)照，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，2種蘚的抗氧化系統(tǒng)受到一定損傷，導(dǎo)致脯氨酸氧化分解。

可溶性糖、可溶性蛋白作為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物抗寒方面起重要調(diào)節(jié)作用[13-15]。植物體內(nèi)可溶性糖含量的增加可以提高細(xì)胞液濃度，增強(qiáng)細(xì)胞保水能力，降低冰點(diǎn)，保持細(xì)胞液水溶狀態(tài)，防止細(xì)胞受到低溫?fù)p傷。同時(shí)在低溫下，增加糖代謝能夠?yàn)闈B透調(diào)節(jié)提供碳骨架，以維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和膜系統(tǒng)穩(wěn)定，防止細(xì)胞溶解結(jié)晶[16-18]。植物體內(nèi)的可溶性蛋白具有很強(qiáng)的親水性，在低溫下能夠束縛大量水分，從而降低細(xì)胞結(jié)冰程度，但其結(jié)構(gòu)和功能對(duì)外界環(huán)境變化很敏感[19]。本研究從可溶性糖和可溶性蛋白含量變化規(guī)律可以發(fā)現(xiàn)，4 ℃ 處理下，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，2種蘚可溶性糖含量呈先上升后下降趨勢(shì)，可溶性蛋白含量顯著上升，說(shuō)明該溫度能激發(fā)2種蘚的抗寒保護(hù)機(jī)制，但并沒(méi)有對(duì)植物組織造成大的傷害。當(dāng)溫度降至-20 ℃時(shí)，2種蘚可溶性糖含量急劇上升，而可溶性蛋白含量急劇下降且極顯著低于對(duì)照，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，該溫度下細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝可能發(fā)生紊亂，蛋白酶系統(tǒng)受到損傷，導(dǎo)致可溶性蛋白水解量大于合成量。當(dāng)脅迫溫度降至-40 ℃時(shí)，2種蘚可溶性糖含量顯著上升，可溶性蛋白含量呈先下降后上升的趨勢(shì)，但在脅迫后期可溶性糖含量與對(duì)照基本持平，可溶性蛋白含量極顯著高于對(duì)照，說(shuō)明2種蘚在大量積累可溶性糖的同時(shí)可能還誘導(dǎo)新的抗凍蛋白合成。當(dāng)溫度繼續(xù)下降至-80 ℃時(shí)，2種蘚可溶性糖、可溶性蛋白含量均急劇上升。說(shuō)明該極端低溫通過(guò)大量積累可溶性糖、可溶性蛋白來(lái)共同抵御寒冷。綜上可知，不同低溫脅迫下，2種蘚可溶性糖積極參與生理代謝，通過(guò)可溶性糖的大量積累防止極端溫度下細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰，維持細(xì)胞組織的水溶性，這與吳娜對(duì)衛(wèi)矛科 3 種常綠闊葉植物的研究結(jié)論[20]一致。-20 ℃ 低溫會(huì)造成2種蘚可溶性蛋白降解，但當(dāng)溫度降至-40、-80 ℃ 時(shí)，2種蘚可溶性蛋白含量極顯著提高，說(shuō)明極端低溫能誘導(dǎo)新的抗凍蛋白的合成，極端低溫下2種蘚通過(guò)可溶性糖、可溶性蛋白的協(xié)同作用來(lái)抵御寒冷，-40 ℃很可能是這些抗凍蛋白合成的臨界溫度，其中-80 ℃下可溶性蛋白大量積累，說(shuō)明隨溫度的降低，這些抗凍蛋白合成量變大。筆者認(rèn)為，可溶性蛋白含量變化對(duì)毛尖紫萼蘚、東亞砂蘚抗寒機(jī)制研究具有指導(dǎo)意義，也為以后苔蘚植物抗寒性研究提供了理論基礎(chǔ)。

目前，葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)已成為研究非生物脅迫對(duì)植物光合作用影響的重要方法[21]。Yield、ETR、qN等葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)參數(shù)。如果植物不受非生物因素影響，Yield、ETR、qN等葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)參數(shù)一般不會(huì)發(fā)生大的波動(dòng)。本研究表明，2種蘚在解除脅迫后1 d，Yield、ETR很低，說(shuō)明在脅迫過(guò)程中光合機(jī)構(gòu)受到一定破壞，造成PSⅡ反應(yīng)中心活性減弱。qN則反映PSⅡ天線(xiàn)色素吸收的光能沒(méi)有被用于光合電子傳遞，而以熱的形式被耗散掉，此時(shí)qN極顯著升高，以熱的形式耗散掉過(guò)剩光能，從而保護(hù)光合電子傳遞鏈不被過(guò)剩光能破壞，維持相對(duì)較高的電子傳遞速率。而在解除脅迫1～4 d，2種蘚的Yield、ETR變化規(guī)律整體保持一致，都呈顯著上升趨勢(shì)，qN極顯著下降，說(shuō)明PSⅡ反應(yīng)中心活性逐漸增強(qiáng)，這可能是2種蘚在解除脅迫過(guò)程中脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白的大量積累保持了類(lèi)囊體膜與細(xì)胞質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)完整性與功能穩(wěn)定性[22-23]，從而使PSⅡ蛋白復(fù)合體能迅速恢復(fù)到正常功能，PSⅡ 反應(yīng)中心受體側(cè)的電子傳遞鏈以及反應(yīng)中心均能得到快速而有效的恢復(fù)，提高實(shí)際光化學(xué)效率，減少過(guò)剩光的積累，其相應(yīng)反應(yīng)中心qN逐漸下降[24]。

綜上所述，2種蘚脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量的變化與抗寒性具有一定的相關(guān)性。在不同低溫脅迫過(guò)程中，2種蘚均能通過(guò)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累來(lái)防止細(xì)胞膜脂的過(guò)氧化，維持細(xì)胞膜的完整性，保證細(xì)胞膜脂各項(xiàng)生理生化反應(yīng)能夠正常進(jìn)行。低溫脅迫過(guò)程中，這3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的峰值出現(xiàn)在不同時(shí)間點(diǎn)，分析認(rèn)為3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在抵御寒冷過(guò)程中有一定的先后順序，相互間通過(guò)協(xié)同作用來(lái)增強(qiáng)2種蘚的抗寒保護(hù)機(jī)制。解除脅迫后，2種蘚滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以及光合特性能夠維持在可恢復(fù)狀態(tài)。因此，毛尖紫萼蘚、東亞砂蘚能夠通過(guò)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及光合特性調(diào)節(jié)來(lái)適應(yīng)寒冷。

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綜上所述，2種蘚脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量的變化與抗寒性具有一定的相關(guān)性。在不同低溫脅迫過(guò)程中，2種蘚均能通過(guò)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累來(lái)防止細(xì)胞膜脂的過(guò)氧化，維持細(xì)胞膜的完整性，保證細(xì)胞膜脂各項(xiàng)生理生化反應(yīng)能夠正常進(jìn)行。低溫脅迫過(guò)程中，這3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的峰值出現(xiàn)在不同時(shí)間點(diǎn)，分析認(rèn)為3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在抵御寒冷過(guò)程中有一定的先后順序，相互間通過(guò)協(xié)同作用來(lái)增強(qiáng)2種蘚的抗寒保護(hù)機(jī)制。解除脅迫后，2種蘚滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以及光合特性能夠維持在可恢復(fù)狀態(tài)。因此，毛尖紫萼蘚、東亞砂蘚能夠通過(guò)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及光合特性調(diào)節(jié)來(lái)適應(yīng)寒冷。

參考文獻(xiàn)：

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