陳曉春，吳華偉，王繼文，鄧 永，郎洪武，高金源?，吳曉薇

（1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081；2.北京出入境檢驗檢疫局，北京100026；3.廣東檢驗檢疫技術中心，廣州510623）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）自 1987年首次發(fā)現(xiàn)以來，在全世界范圍內廣泛流行，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失［1］。特別是以高熱、高發(fā)病率和死亡率為特征的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征已成為長期危害我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重大動物疫病之一。疫苗接種是預防PRRSV疫情發(fā)生的最有效途徑之一。建立科學、有效、規(guī)范的疫苗質量評價體系在疫病防控中發(fā)揮關鍵的作用。大量數(shù)據(jù)已證實豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）能在豬原代肺泡巨噬細胞、傳代細胞 Marc145、MA104、CL11171、CL-2621、HSo2H上生長，只是不同毒株在細胞上的增殖效率存在一定的差異［2］，而關于PRRSV在Vero細胞上的增殖存在異議［3-4］，且相關報道和文獻較少。目前，由于國內各企業(yè)對于PRRSV能否在Vero等細胞上增殖認識不一，且高效、特異的抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒陽性血清制備困難，使得某些企業(yè)往往對樣品不進行特異性血清中和處理便進行外源病毒檢驗，存在干擾真實檢驗結果的風險。為驗證PRRSV在Vero細胞上的增殖情況，本研究將我國目前5個不同的PRRSV活疫苗毒株分別接種Vero細胞，同時通過細胞病變觀察和熒光抗體檢查確定其增殖效果，為規(guī)范PRRSV活疫苗檢驗、保障疫苗質量和豬繁殖與呼吸綜合征疫病防控提供有益的數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥活疫苗（JXA1-R株）、高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥活疫苗（TJM-F92株）、高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥活疫苗（HuN4-F112株）、豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（CH-1R株）、豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（R98株）各1批，每批3瓶，均為符合GMP要求的批簽發(fā)合格產(chǎn)品。

1.1.2 細胞 Vero細胞由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心提供。

1.1.3 試劑 DMEM營養(yǎng)液為Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品；FITC標記的抗PRRSV單克隆抗體為Bio X Diagnostics公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 接種 分別取5種疫苗各3瓶，用不含血清的DMEM營養(yǎng)液分別稀釋為含10頭份／mL，同批苗混合均勻后8000 r／min離心10 min，取上清液接種已長滿80%Vero細胞單層的25 cm2細胞瓶各2瓶，每瓶接種1 mL，37℃吸附1 h，棄掉吸附液，用PBS洗滌1次后補加10 mL含2%胎牛血清的DMEM營養(yǎng)液，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀察細胞病變情況。如出現(xiàn)80%細胞病變，則收獲病毒液。如未見細胞病變，則在培養(yǎng)5 d后收獲培養(yǎng)物。

1.2.2 繼代 將上述收獲的培養(yǎng)物置-70℃凍融3次，3000 r／min離心10 min，取上清液如1.2.1項方法接種Vero細胞，如此繼代，使總培養(yǎng)時間達14 d以上。最后一次繼代時每個樣品分別接種25 cm2細胞培養(yǎng)瓶2瓶和96孔細胞板20孔，37℃培養(yǎng)5～7 d，觀察細胞CPE情況，并進行熒光抗體染色。

1.2.3 熒光抗體染色 取1.2.2項中最后一次繼代的96孔細胞板，棄上清，PBS洗滌2次，用80%丙酮在2～8℃條件下固定20 min，自然干燥后按常規(guī)方法進行熒光染色，并置熒光顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 細胞病變觀察結果 5種疫苗在Vero細胞上傳代培養(yǎng)，均能產(chǎn)生特異性CPE。其中TJM-F92株 PRRSV、HuN4-F112株 PRRSV、CH-1R 株PRRSV在接種的第1代（總培養(yǎng)時間第3天）即出現(xiàn)典型的CPE，JXA1-R株PRRSV在第2代（總培養(yǎng)時間第8天）開始出現(xiàn)典型CPE，R98株PRRSV在第3代（總培養(yǎng)時間第13天）開始出現(xiàn)典型CPE，病變細胞開始表現(xiàn)為圓縮，部分聚集且周圍細胞變形、界限模糊，48 h左右病變細胞圓縮脫落可達80%以上（圖2～圖6）。

2.2 熒光抗體染色結果 5種疫苗樣品在Vero細胞上的第3代細胞培養(yǎng)物經(jīng)FITC標記的抗PRRSV單克隆抗體熒光染色，在感染細胞胞漿內均可見特異性翠綠色熒光（圖8～圖12），對照細胞未見熒光且背景純凈（圖7）。

圖1 正常Vero細胞對照（×200，下同）

圖2 PRRSV CH-1R株病變情況

圖3 PRRSV JXA1-R株病變情況圖

圖4 PRRSV HuN4-F112株病變情況

圖5 PRRSV TJM-F92株病變情況

圖6 PRRSV R98株病變情況

圖7 Vero細胞對照（×200，下同）

圖8 PRRSV CH-1R株熒光檢測結果

圖9 PRRSV JXA1-R株熒光檢測結果

圖10 PRRSV HuN4-F112株熒光檢測結果

圖11 PRRSV TJM-F92株熒光檢測結果

圖12 PRRSV R98株熒光檢測結果

3 討論

《中華人民共和國獸藥典》二〇一〇年版三部規(guī)定［5］，在豬用病毒類活疫苗的外源病毒檢驗中，均應使用Vero細胞進行致細胞病變作用（CPE）和紅細胞吸附性試驗。對于“樣品處理”除另有規(guī)定外，應對待檢毒種或活疫苗用相應的特異性抗血清中和后作為檢品進行檢驗。但在實際檢驗中，為簡化操作步驟，節(jié)約檢驗材料，若疫苗抗原在該檢驗細胞上不能增殖或能夠增殖但無致細胞病變作用（CPE）且無紅細胞吸附作用，可以不用特異性抗血清對疫苗進行中和，即可進行外源病毒檢驗。美國獸用生物制品質量標準9CFR113.300也有相似規(guī)定［6］。本研究將目前國內用于豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗生產(chǎn)的5個毒株未經(jīng)中和接種Vero細胞，發(fā)現(xiàn)該5個毒株均能使Vero細胞產(chǎn)生細胞病變，培養(yǎng)物經(jīng)FITC標記的PRRSV單克隆抗體檢測，在胞漿內也能觀察到特異性熒光。結果提示在進行這5個毒株相關產(chǎn)品的外源病毒檢驗時，需要進行特異性血清中和才能接種Vero細胞，否則在傳代過程中造成的CPE會影響到外源病毒檢驗結果的判定。另外，目前WTO已批準了Vero細胞在疫苗生產(chǎn)中的使用，而Vero細胞微載體培養(yǎng)技術也已成功應用于流感病毒、狂犬病毒、乙型腦炎病毒、脊髓灰質炎病毒、腸道病毒、漢他病毒、牛呼吸道合胞體病毒的培養(yǎng)［7-10］。與轉瓶培養(yǎng)相比，該技術具有產(chǎn)率高、穩(wěn)定性好、易操控、易放大、成本低等優(yōu)點。作為我國重要的動物傳染病之一，PRRSV疫苗生產(chǎn)也應尋求可以替代傳統(tǒng)轉瓶培養(yǎng)的低效能生產(chǎn)模式的新技術新工藝，以有效發(fā)揮疫苗在我國防控政策中的基礎性作用。該研究初步證實了PRRSV能在Vero細胞上增殖，這就提示將Vero細胞的微載體培養(yǎng)技術應用于PRRSV疫苗生產(chǎn)存在一定的可行性，進一步優(yōu)化PRRSV疫苗微載體培養(yǎng)工藝將極大提升其生產(chǎn)水平。

［1］Wensvoort G， Terpstra C， Pol J，et al.Mystery swine disease in the Netherlands：the isolation of Lelystad virus［J］.The Veterinary Quarterly，1991，13： 121-130.

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［6］美國獸用生物制品質量標準.http：／／www.ecfr.gov.

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