黃迪海，劉 霞，盛曉丹，董玉蘭，綦學(xué)慧，張從敬，徐秀榮，張?jiān)佥x，秦卓明，3?

（1.山東省健牧生物藥業(yè)有限公司，濟(jì)南250100；2.濟(jì)南市動(dòng)物生物藥品工程技術(shù)研究中心，濟(jì)南250100；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，濟(jì)南250023；4.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京100094）

獸用雞脾轉(zhuǎn)移因子（Transfer Factor，TF）是具有免疫活性的T淋巴細(xì)胞在抗原或絲裂原的刺激下釋放的一類可透析的小分子多肽，具有增強(qiáng)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，提高機(jī)體免疫功能的作用。TF可將供體的細(xì)胞免疫功能特異地轉(zhuǎn)給受體，而且能轉(zhuǎn)移包括真菌、細(xì)菌、病毒、寄生蟲、組織相容性抗原和腫瘤抗原等多種抗原的細(xì)胞免疫，是一種新型免疫制劑［1］。

自20世紀(jì)50年代首次發(fā)現(xiàn)TF至今，國內(nèi)外研究人員對其進(jìn)行了廣泛深入的研究和應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)TF具有分子質(zhì)量小、無毒、無抗原性、不引起過敏反應(yīng)、不產(chǎn)生特異性抗體，且可超越種屬界限應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)，具有治療免疫缺陷［2］、惡性腫瘤［3］、感染性疾?。?］等作用。1979年以后，國內(nèi)外逐漸將TF應(yīng)用于獸醫(yī)免疫和臨床治療。2011年，我國批準(zhǔn)獸用轉(zhuǎn)移因子口服溶液上市。TF在防治動(dòng)物傳染?。?］、增強(qiáng)機(jī)體免疫［6］、提高疫苗效果［7］等方面效果確切，但其多肽組成不明確，在調(diào)控腸道粘膜屏障中的作用機(jī)理不清楚，嚴(yán)重制約TF的應(yīng)用。本研究旨在探索雞脾轉(zhuǎn)移因子的多肽組成，為進(jìn)一步研究其有效成分和作用機(jī)理提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料 獸用雞脾轉(zhuǎn)移因子，由山東省健牧生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，多肽含量≥1mg／mL，樣品生產(chǎn)批號(hào)為：20121101、20121102、20121103；綿羊靜脈血；新鮮豬胸腺；乙腈、超純水，色譜純；TrisHCL、NaCl、KH2PO4等試劑均為分析純。

1.2 儀器 高速組織搗碎機(jī)，質(zhì)譜儀（LTQVelos），分光光度儀（P-2000），醫(yī)用低速離心機(jī)，恒溫水浴鍋，顯微鏡（XSS-2A）。

1.3 方法

1.3.1 多肽含量測定 按照福林酚Lowry法［8］測定獸用雞脾轉(zhuǎn)移因子樣品溶液的多肽含量。

1.3.2 分子量測定 采用MALDI-TOF-MS法，檢測條件為固體激光源波長355 nm，離子類型為正離子，檢測方式為反射方式（飛行管長2.7 m，加速電壓20 kV，反射電壓23 kV）和線性方式（飛行管長1.22 m，加速電壓kV），基質(zhì)為CHCA和SA。試驗(yàn)樣品溶液ziptip脫鹽后MALDI-TOF-MS分析，根據(jù)分子量圖譜確定樣品分子量。

1.3.3 多肽組成分析

1.3.3.1 樣品處理 樣品用10 kD超濾管離心超濾，通過10 kD超濾管的小肽不用酶解，直接用質(zhì)譜分析，選擇no enzyme。未通過10 kD超濾管的樣品，將超濾管反轉(zhuǎn)后離心，取樣品約 30 μg，加入 30 μL STD buffer，沸水浴 5 min，冷卻至室溫；加入 200 μL UA buffer（8 mol／L Urea，150 mmol／L TrisHCl pH8.5）混勻，轉(zhuǎn)入30 kD超濾離心管，離心；加入200μL UA buffer離心，棄濾液。 加入100 μL IAA（50 mmol／L IAA in UA），振蕩1 min，避光室溫 30 min，離心；加入100 uL UA buffer，離心，重復(fù) 2 次；加入 100 μL 25 mol／LNH4HCO3，離心，重復(fù) 2 次；加入 40 μL Trypsin buffer （2 μg Trypsin in 40 μL25 mol／L NH4HCO3），振蕩1 min ，37 ℃ 16～18 h。 換新收集管，離心，收集濾液，進(jìn)行質(zhì)譜分析，選擇Trypsin。

1.3.3.2 毛細(xì)管高效液相色譜方法 A液為0.1%甲酸的水溶液，B液為0.1%甲酸的乙腈水溶液（乙腈為84%）。色譜柱以95%的A液平衡后，樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到Trap柱。0～105 min，B液線性梯度從4% 到50%；105～114 min，B液線性梯度從50%到100%；114～120 min，B液維持在100%。

1.3.3.3 質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集 多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描后采集20個(gè)碎片圖譜（MS2 scan）。

1.3.3.4 數(shù)據(jù)分析 原始文件用BIOWORKS軟件搜索相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫。查詢IPI數(shù)據(jù)庫CHICK（v3.81）分類系統(tǒng)，得到鑒定的蛋白質(zhì)結(jié)果。

1.3.4 活力測定 按照國家衛(wèi)生部新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)西藥第四十七冊中脫E受體法［8］，制備脫E受體胸腺T細(xì)胞懸液，使最終濃度為每1 mL含3×106～5×106個(gè)細(xì)胞；制備綿羊紅血球懸液，使最終濃度為脫E受體胸腺T細(xì)胞懸液濃度的8～10倍；取供試品，用 Hank’s液配制成每1 mL中含1 mg的供試品溶液；取小試管6支，其中3支各加Hank’s液0.1 mL作為對照管，另3支各加供試品溶液0.1 mL作測定管，每管中各加脫E受體胸腺T細(xì)胞懸液0.2 mL，37℃保溫1 h，加綿羊紅血球懸液 0.2 mL，混勻，500 r／min 離心 3 min，4 ℃冰箱過夜；次日取出，棄上清液，每管中各加固定液1滴，輕輕搖勻，靜置10 min，加染色液2滴并搖勻，靜置15 min后開始計(jì)數(shù)。顯微鏡視野中淡藍(lán)色的較大的細(xì)胞為淋巴細(xì)胞，共數(shù)計(jì)數(shù)板16個(gè)大方格上所有淋巴細(xì)胞的個(gè)數(shù)（不少于200個(gè)），統(tǒng)計(jì)其中的E玫瑰花結(jié)形成的細(xì)胞數(shù)（結(jié)合3個(gè)以上綿羊紅細(xì)胞的淋巴細(xì)胞），計(jì)算結(jié)花百分率，取平均值，即為供試品管或?qū)φ展艿钠骄鶖?shù)。樣品活力＝供試品測定管E玫瑰花結(jié)百分率-對照管E玫瑰花結(jié)百分率。

2 結(jié)果與分析

2.1 多肽含量 用紫外-可見分光光度法，在650 nm波長處測定不同濃度牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1），標(biāo)準(zhǔn)方程為：y ＝ 0.0125x+0.0038（R2＝ 0.9986） 。 樣品10×6 倍稀釋液吸光度檢測值分別為0.330、0.332、0.331，帶入標(biāo)準(zhǔn)方程，計(jì)算，多肽濃度分別為 26.10 μg／mL、26.26 μg／mL、26.18 μg／mL，平均值為 26.18 μg／mL，樣品原液多肽含量平均值為1570.8 μg／mL，符合獸用轉(zhuǎn)移因子口服溶液國家標(biāo)準(zhǔn)多肽含量≥1 mg／mL的規(guī)定。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 分子量 反射模式檢測多肽分子量范圍為800～8000 Da，獲得多種小肽，小肽分子量為800.2175～7475.9980 Da，主要集中于800～4000 Da（圖2）；線性模式檢測分子量范圍為4000～20000 Da，獲得分子量為6017.6611 Da和8279.9307 Da的兩個(gè)多肽（圖3）。

圖2 G1_800_8000_反射模式的分子量圖譜

圖3 G1_4000_20000_線性模式的分子量圖譜

2.3 多肽組成 檢測獲得多肽共計(jì)581種，包括：非酶切方式獲得的多肽共512種，主要有T細(xì)胞凋亡抑制相關(guān)蛋白（TIAL1）、胸腺肽 β4（TMSB4X）、殺菌／通透性增加蛋白（BPIL3）、酶、肌動(dòng)蛋白、血紅蛋白等，具有代表性的多肽（表1）；酶切方式獲得的多肽共 69種，主要有抑制因子活化蛋白（RAP1Ab）、抗菌肽（Cathelicidin-2）、細(xì)胞色素C（Cytochrome c）等，代表性蛋白見表2。

2.4 活力測定 采用脫E受體法測得，對照管16方格所有淋巴細(xì)胞268個(gè)，E玫瑰花結(jié)細(xì)胞31個(gè)，結(jié)花百分率為11.57%，樣品管16方格所有淋巴細(xì)胞289個(gè)，E玫瑰花結(jié)細(xì)胞65個(gè)，結(jié)花百分率為22.49%，樣品活力為10.92%（圖4）。

表1 非酶切方式獲得的具有代表性的多肽

表2 酶切方式獲得的具有代表性的多肽

圖4 顯微鏡下E玫瑰花結(jié)（A為對照品，B為樣品）

3 討論

3.1 轉(zhuǎn)移因子的多肽組成 轉(zhuǎn)移因子作為一種免疫調(diào)節(jié)劑廣泛應(yīng)用于人醫(yī)和獸醫(yī)領(lǐng)域。國家標(biāo)準(zhǔn)［編號(hào)：WS1-（X-451）-2003Z］中規(guī)定了其主要成分是多肽和核苷酸。國內(nèi)眾多研究人員對轉(zhuǎn)移因子的氨基酸組成、多肽含量、多肽與核苷酸比例、活性成分混合物等進(jìn)行了研究。何理平［9］報(bào)道，轉(zhuǎn)移因子多肽與小分子RNA的比例為2∶1。范振青等［10］對豬脾轉(zhuǎn)移因子水解后檢測，證實(shí)其含16種氨基酸，其中以天冬氨酸，谷氨酸和甘氨酸含量較高。劉剛等［11］對轉(zhuǎn)移因子進(jìn)行氨基酸分析，測得組成多肽的氨基酸占總氨基酸的1／3，游離氨基酸占2／3。凌紅麗［12］采用凝膠色譜層析法分離轉(zhuǎn)移因子得到三個(gè)洗脫峰并進(jìn)行活性測定，表明轉(zhuǎn)移因子主要包含三大組分。本試驗(yàn)在驗(yàn)證雞脾轉(zhuǎn)移因子多肽含量的基礎(chǔ)上，利用LC-MS法檢測其多肽組成，揭示了雞脾轉(zhuǎn)移因子含有T細(xì)胞凋亡抑制相關(guān)蛋白（TIAL1）等581種多肽，并通過查詢數(shù)據(jù)庫，獲得了對應(yīng)的蛋白序列，初步闡明了雞脾轉(zhuǎn)移因子的多肽組成，為國內(nèi)首次報(bào)道。

3.2 轉(zhuǎn)移因子分子量及其分布 轉(zhuǎn)移因子的分子量一般在3000～15000 Da。本試驗(yàn)利用質(zhì)譜法分析測定雞脾轉(zhuǎn)移因子分子量分布范圍為800 Da～8280 Da，主要為分布于4000 Da以下。雖然利用上述方法測定的分子量都在10000 Da以下，但是在多肽組成測定試驗(yàn)中，仍然分析到了69種分子量大于10000 Da的多肽，具體原因有待進(jìn)一步研究。

3.3 轉(zhuǎn)移因子功能與組分的關(guān)系 轉(zhuǎn)移因子具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫［13-14］和體液免疫［15］，增強(qiáng)非特異性免疫［16］、抗免疫抑制［17］等作用，但具體是何種成分發(fā)揮作用暫無報(bào)道。本試驗(yàn)在檢測確定雞脾轉(zhuǎn)移因子生物活性的基礎(chǔ)上，對其所含多肽進(jìn)行分析，證實(shí)了轉(zhuǎn)移因子含有與細(xì)胞結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)相關(guān)的肌動(dòng)蛋白，含有與免疫相關(guān)的T細(xì)胞凋亡抑制相關(guān)蛋白、胸腺肽、抑制因子活化蛋白等，含有與生長發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子蛋白，含有與抗應(yīng)激相關(guān)的熱休克蛋白，含有與疫病相關(guān)的殺菌／通透性增加蛋白、抑癌蛋白、抗菌肽等。上述蛋白均具有一定的生物學(xué)活性，可能與轉(zhuǎn)移因子的功能密切相關(guān)。下一步需要通過基因合成和體外表達(dá)等方式獲得相關(guān)多肽蛋白，進(jìn)一步研究其生物活性，進(jìn)而驗(yàn)證雞脾轉(zhuǎn)移因子的有效成分和作用機(jī)理。

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