胡中蓮，孟祥輝

（1.長春市雙陽區(qū)醫(yī)院 婦產科，吉林 長春130600；2.吉林大學基礎醫(yī)學院，吉林 長春130021）

盆腔炎是是婦女的常見病、多發(fā)病之一，有時表現(xiàn)出慢性遷延、纏綿難愈，且復發(fā)率高。西醫(yī)治療主要使用抗生素，反復使用抗生素易產生耐藥性，影響機體免疫功能，藥物不良反應明顯。近年來，隨著將中藥用于治療盆腔炎，并獲得較好的臨床療效。在這些用于治療急慢性的中成藥的方劑中有味藥是五味子，五味子為木蘭科植物五味子或華中五味子的干燥成熟果實，是著名的滋補性中藥。隨著現(xiàn)代化科技的發(fā)展和現(xiàn)代藥理的研究，五味子的功效被漸漸的揭開，為中藥走向世界打下堅實基礎。目前研究證明，五味子的主要化學成分有木脂素，揮發(fā)油和多糖，其次還有有機酸，脂肪油等[1，2]。其中木脂素包括：五味子素、五味子甲素、五味子乙素等20多種成分[2]。關于五味子木脂素的化學成分及生物活性研究的報道很多，但目前關于五味子木脂素的抗炎作用機理的研究尚不清楚。因此本實驗以中醫(yī)藥理論為指導，通過細胞法建立炎癥細胞模型，應用酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）及分子生物學技術探討五味子乙素的抗炎作用。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

健康雌性昆明種小鼠，體重17－22g（由吉林醫(yī)藥學院實驗動物中心提供）；地塞米松磷酸鈉注射液（吳中醫(yī)藥公司）；小牛血清（杭州四季清）；五味子乙素標準品（維克奇生物公司）；青鏈霉素混合液、IMDM、MTT、PBS、RNA 提取試劑盒、RT－PCR試劑盒及DNA－Marker（北京鼎國生物技術有限公司）；NO試劑盒（南京建成生物工程研究所）；小鼠IL－6、TNF－α檢測試劑盒（RND分裝）

1.2 巨噬細胞制備

取6－8w齡昆明小鼠5只，每只小鼠腹腔注射3%巰基乙醇酸鈉1ml，飼養(yǎng)3d。第3d脫頸處死，75%酒精浸泡5 min后，無菌條件下，倒立小鼠并腹腔注入無血清IMDM培養(yǎng)液5ml，仰臥平放并輕輕揉腹部2min，用鑷子稍提起腹腔，并用剪子剪開一個小口，用吸管輕輕吸取細胞懸液，移入離心管中，1 000rpm離心5min，棄去上清。用PBS充分洗滌2次，1 000rpm離心5min，棄去上清后顯微鏡下計數(shù)，用IMDM培養(yǎng)液（含10%小牛血清，青鏈霉素混合液）調整細胞至所需濃度2.5×105個／ml，接種于96孔板中，每孔100 μl，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h后換液，去除未貼壁細胞，以備后續(xù)實驗應用。

1.3 炎癥細胞模型制備及分組

取一板已培養(yǎng)于96孔板的細胞，換液后，隨機分為4組。Normal組：加入與實驗組同體積的DMSO；DEX組：加1×10－7mmol／L地塞米松作為陽性對照；LPS組：單獨加終濃度1.1×10－2mmol／L脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）；Schisandrin＋LPS組：根據(jù)給五味子乙素劑量不同分為4×10－5mmol／L組、4×10－6mmol／L組、4×10－7mmol／L組、4×10－8mmol／L組。各組3平行孔，培養(yǎng)24h。

1.4 RT－PCR檢測IL－1β的表達

將各組細胞用0.25%的胰酶消化、離心，依照總RNA提取試劑盒的操作步驟，提取總RNA，取出1μl總RNA樣品稀釋100倍后，紫外分光光度計測定OD260和OD280，計算其濃度和純度。另取出5μl總RNA樣品用于瓊脂糖凝膠電泳觀察RNA的完整性。

從GeneBank中檢出小鼠IL－1β基因cDNA序列（IL－1β：基因編號NM008361，cDNA大小為1 328bp）。選用看家基因β－actin作為內參照（β－actin：基因編號 NM007393，cDNA大小為1 891bp）。IL－1β的上游引物為5’－ctgaaagctctccacctc－3’，下游引物為5’－tgctgatgtaccagttgggg－3’。β－actin的上游引物為5’－gttaccaactgggacgaca－3’，下游引物為5’－aagcctcagggcatcg－3’。按照RT－PCR試劑盒步驟進行擴增。擴增產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照，測定其電泳條帶的灰度值。

1.5 ELISA測定巨噬細胞培養(yǎng)基中IL－6、TNF－α和 NO的含量

各組細胞37℃孵育24h后，收集培養(yǎng)基，并分別嚴格按照小鼠IL－6、TNF－α及NO定ELISA劑盒使用說明操作進行測定。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 五味子乙素對小鼠巨噬細胞中IL－1βmRNA表達的影響

Schisandrin組的巨噬細胞中IL－1βmRNA表達水平明顯低于LPS組，DEX組巨噬細胞中IL－1βmRNA表達水平也明顯低于LPS組，并且Schisandrin組巨噬中IL－1βmRNA表達明顯低于DEX組（圖1，表1）。

圖1 IL－1β基因RT－PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳

表1 各組單核巨噬細胞中IL－1βmRNA表達水平比較（±s，n＝5）

表1 各組單核巨噬細胞中IL－1βmRNA表達水平比較（±s，n＝5）

＊compared with LPS group，P＜0.05；△compared with DEX group P＜0.05

5 1.012±0.031 DEX Group 5 0.640±0.019＊LPS Group 5 1.025±0.042 Schisandrin＋LPS Group 4×10－5 mmol／L 5 0.327±0.122＊△4×10－6 mmol／L 5 0.486±0.122＊△4×10－7 mmol／L 5 0.526±0.122＊4×10－8 mmol／L 5 0.587±0.122－actin Normal Group Group n IL－1β／β＊

2.2 五味子乙素對巨噬細胞分泌IL－6，TNF－α，NO的影響

Schisandrin＋LPS組巨噬細胞炎癥模型上清液中的IL－6、TNF－α和NO含量明顯低于LPS組和Normal組，經方差分析結果顯示，隨著五味子乙素作用效果呈劑量依賴性（表2）。

表2 五味子乙素對巨噬細胞分泌IL－6、TNF－α和NO的影響（±s，n＝5）

表2 五味子乙素對巨噬細胞分泌IL－6、TNF－α和NO的影響（±s，n＝5）

＊Compared with Normal group，P＜0.05

Group dose（μl） TNF－α（mmol／L） IL－6（mmol／L） NO（mmol／L）Normal Group 0.4 0.0426±0.0007 0.0726±0.0007 0.530±0.003 DEX Group 0.4 0.0252±0.0005＊ 0.0452±0.0005＊ 0.262±0.003＊LPS Group 0.4 0.0419±0.0005 0.0719±0.0005 0.512±0.004 Schisandrin＋LPS Group 4×10－5 mmol／L 0.4 0.0216±0.0003＊ 0.0366±0.0003＊ 0.211±0.005＊4×10－6 mmol／L 0.4 0.0246±0.0002＊ 0.0386±0.0002＊ 0.240±0.003＊4×10－7 mmol／L 0.4 0.0372±0.0002＊ 0.0672±0.0002＊ 0.402±0.006＊4×10－8 mmol／L 0.4 0.0385±0.0002＊ 0.0685±0.0002＊ 0.461±0.004＊

3 討論

炎癥反應是人體疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素，許多婦科疾病均與炎癥反應有關。巨噬細胞在炎癥中的地位尤為重要，活化的巨噬細胞通過分泌多種趨化因子，誘導更多的巨噬細胞活化、募集并產生白介素－1β（interleukin－1β，IL－1β）、IL－6和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor－α）等多種促炎因子[3]，從而加強局部的炎癥反應，因此巨噬細胞所分泌炎性因子的水平可以用來檢測藥物抗炎作用的一個重要指標?；诖耍覀兝眉毦砻娓叨缺Ｊ胤肿覮PS來刺激巨噬細胞[4]，研究五味子乙素對于LPS誘發(fā)的巨噬細胞炎癥模型中炎性因子表達和含量的影響。實驗結果顯示，給予五味子乙素處理巨噬細胞炎癥模型，巨噬細胞中IL－1βmRNA的表達降低，同時也觀察到巨噬細胞分泌IL－1量降低，提示五味子乙素具有抗炎作用。

TNF－a是炎癥反應早期最重要細胞因子之一，是一種有活化的巨噬細胞分泌的促炎癥因子，具有活化內皮細胞、中性粒細胞等作用，是導致炎性介質級聯(lián)反應的始發(fā)因子。在炎癥過程中TNF－α在局部組織中出現(xiàn)較早，并迅速達到高峰，從而誘發(fā)“次級”細胞因子如IL－6、IL－1β等的生成，是激活細胞因子級聯(lián)反應主要介質，增強中性粒細胞的吞噬活性，合成和釋放IL－6、IL－1、IL－8等[5]。巨噬細胞經過 LPS刺激后，分泌TNF－a增高，給予五味子乙素后TNF－a分泌量降低。同時也觀察到NO的分泌量也有相似趨勢。

NO具有細胞內和細胞間信使以及神經遞質作用的信息分子，參與很多病理和生理的過程。而過多NO通常伴隨免疫紊亂和炎癥等[6]，NO的生物合成是在一氧化氮合酶（NOS）催化和輔助因子存在下由L－精氨酸與氧分子反應而來。誘導型NOS（iNOS）在靜息細胞內是不表達的，當細胞受到細胞因子，其它微生物或免疫刺激下，iNOS表達才能增加并產生大量NO引起炎癥反應[7]。NO是一種重要免疫分子和炎癥介質，在炎癥發(fā)展中具有雙重作用，一方面通過刺激巨噬細胞誘導受感染細胞死亡和炎癥，起到對抗外源性微生物的細胞毒作用，另一方通過促進周邊非損傷細胞毒性或細胞炎癥，加劇膿毒癥，自身免疫或超敏反應的組織損傷[8]。

綜上所述，在炎癥反應過程中NO和TNF－α的增加可以誘發(fā)IL－6、IL－1β等炎性因子的生成，五味子乙素可通過IL－1β、TNF－α、IL－6、NO表達的抑制發(fā)揮其抗炎的作用，為進一步開發(fā)五味子乙素這種抗炎中藥制劑提供理論依據(jù)。

[1]Zeng KW，Zhang T，F(xiàn)u H，et al.Schisandrin B exerts anti－neuroinflammatory activity by inhibiting the Toll－like receptor 4－dependent MyD88／IKK／NF－κB signaling pathway in lipopolysaccharide－induced microglia[J].Eur J Pharmacol，2012，692（1－3）：29.

[2]Tang J，Shao B，Liu Y，et al.Highly sensitive determination of Schisandrin and Schisandrin B in plasma of rats after administration of Wurenchun （Fructus Schisandrae Chinensis Extracts）preparations by LC－ESI－MS／MS[J].Biomed Chromatogr，2010，24（6）：675.

[3]Jayaraman P，Sada－Ovalle I，Nishimura T，et al.IL－1βpromotes antimicrobial immunity in macrophages by regulating TNFR signaling and caspase－3activation[J].J Immunol，2013，190（8）：4196.

[4]Chelvarajan RL，Liu Y，Popa D，et al.Molecular basis of age－associated cytokine dysregulation in LPS－stimulated macrophages[J].J Leukoc Biol，2006，79（6）：1314.

[5]Mori T，Miyamoto T，Yoshida H，et al.IL－1βand TNFα－initiated IL－6－STAT3pathway is critical in mediating inflammatory cytokines and RANKL expression in inflammatory arthritis[J].Int Immunol，2011，23（11）：701.

[6]Crowell，Steele VE，Sigman CC，et al.Is inducible nitric oxide synthase a target for chemoprevention[J].Mol Cancer Ther，2003，2（8）：815.

[7]Panaro MA，Brandonisio O，Acquafredda A，et al.Evidences for iNOS expression and nitric oxide production in the human macrophages[J].Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord，2003，3（30）：210.

[8]Ana LV，Margarida GM.Teresa C，et al.Dexamethasone prevents granulocyte／macrophage colony stimulating factor－induced nuclear factor－kB activation，inducible nitric oxide synthase expression and nitric oxide production in a skin dendritic cell line[J].Mediators Inflamm，2003，12（2）：71.