張桐菲，王城坤，洪麗華，張志民

（吉林大學口腔醫(yī)院，吉林 長春130021）

齲病是口腔最常見感染性疾病，變形鏈球菌是主要致齲菌，其致齲性主要取決于其產(chǎn)酸性和耐酸性。耐酸性是指細菌能在低環(huán)境中生長和代謝的能力[2]。氟化物作為有效的防齲藥物，在臨床廣泛的應用，相關(guān)的口腔菌群為適應新環(huán)境產(chǎn)生了耐氟的變形鏈球菌株[3]。所以，探討變形鏈球菌出現(xiàn)耐氟菌株后相關(guān)致齲基因就顯得尤為重要了。目前已分離并克隆了多個與變形鏈球菌耐酸性相關(guān)的基因，其中耐酸相關(guān)基因ffh受到國內(nèi)外學者的密切關(guān)注。本實驗擬篩選鑒定出使ffh基因沉默的siRNA片段，為探討變形鏈球菌耐氟菌株ffh基因在控制細菌耐酸性、產(chǎn)酸性以及生物膜形成等方面的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

變形鏈球菌S.mutans UA159（購自上海交通大學口腔醫(yī)學院）；BHI培養(yǎng)基（購自青島海博生物技術(shù)有限公司）；RNA提取試劑盒、實時熒光定量通用試劑（購自 TaKaRa公司 大連）；BIO－RAD MicroPulser電轉(zhuǎn)儀；VITEK2－compact細菌鑒定儀（法國）；ffh基因siRNA序列4組由上海吉瑪公司合成：siRNA1：sense：GCUCAACUCUGACAUAUCUT，antisense：AGAUAUGUCAGAGUUGAGCTT；siRNA2：sense：GACUAGCCUUCUCAAUUAATT，antisense：UUAAUUGAGAAGGCUAGUCTT；siRNA3：sense：GCCAGACCUUGACUUACAATT，antisense：UUGUAAGUCAAGGUCUGGCTT；siRNA4：sense：GACCGACCAUCAUGAUAAUTT，antisense：AUUAUCAUGAUGGUCGGUCTT。

1.2 方法

1.2.1 變形鏈球菌耐氟菌株的誘導與鑒定 將－80℃甘油保存的S.mutans UA159取出，利用本實驗室常規(guī)耐氟菌株誘導方法獲得UA159－FR[4]。觀察菌落形態(tài)、革蘭染色鑒定、生化鑒定。

1.2.2 細菌轉(zhuǎn)染 按200ml BHI培養(yǎng)液（含有5%5M 甘氨酸），加入4ml（OD600＝0.2）UA159－FR細菌的比例接種，37℃厭氧培養(yǎng)（95%N2，5%CO2）16 h。放在冰上預冷10min，將菌液轉(zhuǎn)移到離心管中，在4℃6 000rpm離心10min，棄上清。加入50ml無菌Elpo培養(yǎng)液，混勻，8 000rpm，離心10min，棄上清。加入30ml無菌Elpo培養(yǎng)液，12 000rpm離心10min，棄上清，將沉淀細菌放入含有1ml冰冷無菌Elpo培養(yǎng)液的EP管中，放在冰上，等待電轉(zhuǎn)。按400μl細菌懸液加入200pmol siRNAoligo的比例充分混勻，加入0.2電轉(zhuǎn)杯中，放在冰上10min。啟動開關(guān)，將電壓調(diào)整為1.6kV。取出電轉(zhuǎn)杯[8]，用移液器吸取300μl電轉(zhuǎn)混合液，加入1ml BHI培養(yǎng)液中，37℃厭氧培養(yǎng)（95%N2，5%CO2）12h24 h分別收樣，用于檢測。

1.2.3 總RNA提取 將細菌用預冷PBS緩沖液洗2遍，加1ml Ezol裂解液重懸。加入0.2ml三氯甲烷，劇烈搖動10s，室溫放置3min，4℃，12，000 x g離心20min。將上清水相轉(zhuǎn)移至另一新的無RNA酶離心管中，并加入等體積的100%乙醇。吸取樣品，加入帶有2ml收集管的mini－spin離心柱。8，000xg，室溫離心15s，棄盡流穿液。將剩余的樣品轉(zhuǎn)移至離心柱，重復第4步。往離心柱中加入700μl Wash Buffer，輕蓋蓋子，8，000xg，室溫離心15s，棄盡流穿液。重復第6步，用500μl Wash Buffer洗滌離心柱三次。將離心柱轉(zhuǎn)移至一新的無RNA酶的1.5ml離心管中，往硅膠膜中央滴加50 μl DEPC水，4℃，10，000xg離心3min洗脫RNA。測定OD260、OD280，計算RNA濃度。瓊脂糖電泳檢查RNA的完整性。

1.2.4 Real－time PCR 檢測ffh基因 mRNA 的表達 PCR反應體系中所加入的引物分別為：ffh基因引物（上游引物 AGGCTAAGAAGATGATGCAAGG，下游引物 CACATCCATATTAGTACCGCTCA，擴增長度為176bp），內(nèi)參16sRNA引物（上游引物 GTAGTTAGCCGTCCCTTTCTG，下游引物ACGATACATAGCCGACCTGAG，擴增長度為237bp）。具體操作見表1、表2。

表1 mRNA逆轉(zhuǎn)錄反應體系

表2 mRNA實時熒光定量反應體系

反應產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，以16sRNA為內(nèi)參，計算ffh基因的相對密度值。實驗樣品重復3次，以精確計算均值與標準差，用以表示基因的表達水平。

2 結(jié)果

2.1 變形鏈球菌耐氟菌株的誘導與鑒定 鏡下觀察UA159－FR，可見細菌革蘭染色陽性，呈球狀、短鏈狀排列，與變形鏈球菌形態(tài)相符合（圖1）。單菌經(jīng)生化鑒定證實99.9%的可能性是變形鏈球菌。

圖1 變形鏈球菌耐氟菌革蘭染色

2.2 細菌轉(zhuǎn)染 將帶有熒光標記物的高濃度的空白對照NC－FAM oligo加入菌液中，可在熒光倒置顯微鏡下觀察到當轉(zhuǎn)染成功后有綠色點狀熒光標記。圖2A和B分別表示同一視野下，未經(jīng)過電穿孔處理的混合液37℃厭氧培養(yǎng)（95%N2，5%CO2）24h后在熒光倒置顯微鏡下用日光和熒光照射的細菌的狀態(tài)?？汕逦匆妶DA內(nèi)有大量細菌，圖2B為單純熒光反射未見類似細菌形態(tài)及熒光點。圖2C和2D分別表示同一視野下，經(jīng)過1.6kV電穿孔處理的混合液37℃厭氧培養(yǎng)（95%N2，5%CO2）24h后在熒光倒置顯微鏡下用日光和熒光照射的細菌狀態(tài)。圖2C中可觀察到部分成團狀的細菌團塊，圖2D中可觀察到圖2C中的大部分團塊有熒光標記，少部分無熒光標記。由此可見電穿孔轉(zhuǎn)染是可行的。

圖2 細菌電轉(zhuǎn)的圖片

2.3 RT－PCR 檢測RNA電泳28srRNA、18s rRNA條帶清晰可見，說明RNA未降解；OD值測定 A260／A280在1.9－2.2之間，提取過程中沒有蛋白污染，見圖3。

圖3 總RNA提取電泳圖

用1.6kV電壓轉(zhuǎn)染ffh基因的靶向siRNA oligo，通過RT－PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染及沉默效果。以樣品B－12和B－24為空白對照，圖4B16srRNA為內(nèi)參基因，分別觀察轉(zhuǎn)染后12和24h的ffh表達。圖4A的電泳結(jié)果可以清楚觀察到PCR產(chǎn)物大小正常，沒有雜帶，且空白對照組沒有目的條帶。f1－12表示ffh基因的靶向siRNA1轉(zhuǎn)染12h，f1－24表示ffh基因的靶向siRNA1轉(zhuǎn)染候24h，

圖4A 12h，24hffh基因的靶向siRNA表達

圖4B 內(nèi)參16srRNA的表達

2.4 Real－time PCR相對定量柱狀圖結(jié)果 實時定量結(jié)果整理后用柱形圖表示（如圖5），以樣品B－12和B－24為校準16srRNA為內(nèi)參基因分別觀察轉(zhuǎn)染后12和24h的ffh表達，結(jié)果顯示f2干擾片段干擾效果較穩(wěn)定。

圖5A 以B－12為校準12h16srRNA為內(nèi)參stm－Ffh基因水平

3 討論

圖5B 以B－24為校準24h16srRNA為內(nèi)參stm－Ffh基因水平

siRNA是一種以mRNA為基礎的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制，具有高特異性可以抑制靶基因的表達，維持遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性[5]。其作用原理是siRNA的反義鏈與mRNA分子的特異性序列結(jié)合，使得mRNA降解，所以siRNA和mRNA上的靶序列配對結(jié)合是發(fā)揮作用的關(guān)鍵。在同一基因不同位置的siRNA序列對該基因的沉默結(jié)果可以有很大差別[6]。廣泛應用于抗病毒和抗腫瘤細胞的研究當中[7]，但在真核生物研究方面進展較緩慢目前沒有持久穩(wěn)定表達且在治療細菌感染方面的運用也很少[9]。電轉(zhuǎn)化發(fā)轉(zhuǎn)化效率高于化學方法，常用于對轉(zhuǎn)化效率要求較高的實驗中[10]，本實驗分別在轉(zhuǎn)染后12h和24h收集數(shù)據(jù)顯示siRNA可以有效抑制ffh基因的表達。本實驗中，我們根據(jù)siRNA設計原則，參照ffh mRNA序列設計出4對siRNA序列及一對陰性對照序列通過電穿孔法轉(zhuǎn)染變形鏈球菌耐氟菌UA159－FR菌株。結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染12h內(nèi)除siRNA1外其他3對siRNA都可以抑制ffh基因的表達，而在轉(zhuǎn)染超過12h達到24h后，只有siRNA2可以更穩(wěn)定的抑制ffh基因的表達。

本實驗證明，在研究細菌的基因沉默中，siRNA是可以有效抑制靶向基因表達的，但當轉(zhuǎn)染時間超過24小時后部分轉(zhuǎn)染的特意位點會恢復原有的表達，即siRNA在干擾過程中表現(xiàn)并不十分穩(wěn)定。但針對UA159－FR菌株這類生長周期較短的細菌，siRNA干擾是可以起到有效抑制作用。siRNA技術(shù)可以有效的抑制變形鏈球菌耐氟菌株耐酸基因ffh的表達，為探討UA159－FR菌株ffh基因是否調(diào)控產(chǎn)酸、耐酸作用奠定基礎。

[1]Holen T，Amarzguioui M，Wiiger M T，et al.Positional effects of short interfering RNAs targeting the human coagulation trigger tissue factor[J].Nucleic Acids Reserch，2002，30（8）：1757.

[2]Svensater G，Sjogreen B，Hamiltion IR.Multiple stress responses in streptococcus mutans and induction of general and stress－specific protein[J].Nature，2000，146（1）：107.

[3]劉 莉，張志民，王麗穎，等.變形鏈球菌耐氟菌株中耐酸相關(guān)基因gluA突變的檢測及其意義[J].吉林大學學報（醫(yī)學版），2011，37（1）：80.

[4]趙洪巖，張志民，朱來寬，等.變形鏈球菌耐氟菌株的體外誘導[J].中國實驗診斷學，2010，14（7）：1095.

[5]嚴燕國，詹文化，趙 剛，等.siRNA特異性抑制幽門螺旋桿菌CagA基因表達的實驗研究[J].中國人獸共患病學報，2006，22（4）：330.

[6]Fire A，Xu S，Montgomery MK，et al.Potent and specific genetic interference by double－stranded RNA in caenorhabditis elegans[J].Nature，1998，391（6669）：806.

[7]Elbashir SM，Harborth J，Lendeckel W，et al.Duplexes of 21－nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells[J].Nature，2001，441：494.

[8]Liang W，Zhang WJ，Gao QM，et al.Silencing of surviving gene in jeko－1cell line with small interfering RNA[J].Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi，2012，20（1）：88.

[9]耿先龍，馬筱玲.RNA干擾技術(shù)及其在抗微生物感染方面的進展[J].國際檢驗醫(yī)學雜志，2007，28（8）：733.

[10]顧長國，賈淑芳，劉 琛，等.外源性DNA電轉(zhuǎn)化導入XL1－blue

菌株條件的優(yōu)化[J].西南國防醫(yī)藥，2009，19（5）：507.作者簡介：張桐菲（1988－），女，吉林省長春市人，在讀醫(yī)學碩士，主要從事齲病病因?qū)W及臨床研究。