曹林林，杜珍武，楊麒巍，侯治富＊

（1.淄博市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，山東 淄博255036；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 中心研究室，吉林 長(zhǎng)春130033）

腫瘤細(xì)胞的分化程度是癌癥診斷和治療中一個(gè)重要的參考的數(shù)據(jù)，在研究腫瘤細(xì)胞分化過程中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分化與細(xì)胞停滯聯(lián)系密切[1，2]，每一次細(xì)胞分化都伴有細(xì)胞周期停滯[3]。

本研究利用乙酸肉豆蔻佛波醇（PMA）[4]體外誘導(dǎo)單核白血病細(xì)胞系——U937細(xì)胞分化為研究對(duì)象，通過對(duì)在有無血清培養(yǎng)條件下細(xì)胞形態(tài)及周期的變化，探討調(diào)控細(xì)胞分化成熟的機(jī)制，并為白血病的研究性治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

U937細(xì)胞株來自吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院中心研究室，胎牛血清（FCS），IMDM培養(yǎng)基，青鏈霉素均購(gòu)于Hyclone公司，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司，PMA購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

1.2 U937細(xì)胞培養(yǎng)

將U937細(xì)胞株復(fù)蘇后接種于含15%胎牛血清和100ml／L青鏈霉素的IMDM培養(yǎng)基中。置于含有5%CO2，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 血清為培養(yǎng)調(diào)節(jié)因素情況下PMA誘導(dǎo)U937細(xì)胞分化

根據(jù)在U937細(xì)胞培養(yǎng)過程中是否添加血清與PMA，將細(xì)胞分成4組：①FCS組：U937細(xì)胞置于含有10%FCS的IMDM培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)；②FCS＋PMA組：U937細(xì)胞置于含有10%FCS與10ng／ml PMA的IMDM培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)；③NOFCS組：U937細(xì)胞置于無FCS的IMDM培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)；④NOFCS＋PMA組：U937細(xì)胞置于無FCS但含有10 ng／ml PMA的IMDM培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后應(yīng)用倒置顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、貼壁率計(jì)算與細(xì)胞周期檢測(cè)。

1.4 血清恢復(fù)實(shí)驗(yàn)

分別取NOFCS和NOFCS＋PMA組培養(yǎng)24 h U937細(xì)胞，以1×106／瓶將其接種于含血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后應(yīng)用倒置顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、貼壁率計(jì)算以及細(xì)胞周期檢測(cè)。

1.5 分化后細(xì)胞的無血清培養(yǎng)

將FCS＋PMA組細(xì)胞培養(yǎng)24h后，分別置于含有血清培養(yǎng)基與無血清培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)24h后應(yīng)用倒置顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、貼壁率計(jì)算與細(xì)胞周期檢測(cè)。

1.6 細(xì)胞貼壁率測(cè)定

分別收集各組懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞，應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（TC10，Bio－Rad）進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照下面公式進(jìn)行貼壁率計(jì)算：細(xì)胞貼壁率%＝貼壁細(xì)胞數(shù)／（懸浮細(xì)胞數(shù)＋貼壁細(xì)胞數(shù)）。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

取各組細(xì)胞，用PBS洗滌1次。經(jīng)75%的冷酒精固定18h，1 000r／min離心5min，去除酒精，用PBS滌洗3次，加入PBS 0.5ml。用350目紗網(wǎng)過濾后加入RNA酶100μl振蕩，37℃水浴30min。加入碘化丙啶（PI）400μl振蕩，4℃30min后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，細(xì)胞貼壁率、細(xì)胞周期數(shù)據(jù)均以Mean±SD表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 血清對(duì)U937細(xì)胞分化過程的細(xì)胞形態(tài)影響

在FCS組細(xì)胞在血清培養(yǎng)基內(nèi)為圓形、懸浮、分散生長(zhǎng)（圖1A），F(xiàn)CS＋PMA組細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞相互粘附成團(tuán)，細(xì)胞顆粒度增多（圖1B）；NOFCS組細(xì)胞懸浮、分散生長(zhǎng)（圖1C）；NOFCS＋PMA組細(xì)胞部分聚集生長(zhǎng)，大部分細(xì)胞仍懸浮生長(zhǎng)（圖1D），說明血清在PMA誘導(dǎo)的U937細(xì)胞分化過程對(duì)于細(xì)胞的形態(tài)具有一定影響。

圖1 U937細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下形態(tài)學(xué)變化（200×）

2.2 血清對(duì)U937細(xì)胞分化過程的細(xì)胞貼壁率影響

FCS＋PMA組細(xì)胞貼壁率明顯高于其他3組，而NOFCS＋PMA組細(xì)胞的貼壁率與FCS組，NOFCS組無明顯差異，說明血清在PMA誘導(dǎo)的U937細(xì)胞分化過程對(duì)于細(xì)胞的貼壁具有一定影響。結(jié)果見表1。

2.3 血清對(duì)U937細(xì)胞分化過程的細(xì)胞周期影響

與FCS組（圖2A）相比，F(xiàn)CS＋PMA（圖2B）、NOFCS（圖2C）和NOFCS＋PMA組（圖2D）細(xì)胞周期的G1細(xì)胞明顯增多，而S期細(xì)胞明顯減少，相比有顯著差異，說明血清可以影響U937細(xì)胞的細(xì)胞周期改變，結(jié)果見圖2，表2。

表1 各組細(xì)胞的貼壁率

圖2 各組細(xì)胞的細(xì)胞周期直方圖

表2 各組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布

2.4 血清恢復(fù)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察與細(xì)胞周期結(jié)果

NOFCS組與NOFCS＋PMA組細(xì)胞置于含有15%血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后，NOFCS組細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)（圖3A），細(xì)胞周期結(jié)果分析顯示與血清恢復(fù)前NOFCS組相比，G1期細(xì)胞數(shù)目明顯減少，S期細(xì)胞明顯增多（圖4A，表3）；NOFCS＋PMA組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，聚集成團(tuán)（圖3B），細(xì)胞周期結(jié)果分析顯示與血清恢復(fù)前NOFCS＋PMA組相比，細(xì)胞周期無明顯改變（圖4B，表3）。

圖3 血清恢復(fù)后NOFCS組與NOFCS＋PMA組細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

圖4 血清恢復(fù)后NOFCS組與NOFCS＋PMA組細(xì)胞周期觀察結(jié)果

表3 血清作用前后U937細(xì)胞周期分布的變化

3 討論

U937細(xì)胞是一種前單核細(xì)胞株，其特點(diǎn)為經(jīng)一定刺激后可向單核巨噬細(xì)胞方向分化，目前，U937細(xì)胞已經(jīng)成為體外研究細(xì)胞分化機(jī)制常規(guī)使用的細(xì)胞模型之一。乙酸肉豆蔻佛波醇（Phorbol－12－myristate 13－acetata，PMA），是二脂酰甘油（DG）的類似物，可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，代替DG的活性激活蛋白酶（PKC）的活性[5]，引起細(xì)胞內(nèi)一系列的生物學(xué)效應(yīng)。在體外，PMA可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞系的分化[6，7]，是一種實(shí)用良好、性能穩(wěn)定的誘導(dǎo)分化劑。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，血清作為獨(dú)立的影響因素，在腫瘤細(xì)胞體外生長(zhǎng)過程中起著重要作用，主要由于血清含有細(xì)胞增殖與生存的必需營(yíng)養(yǎng)素如某些生長(zhǎng)因子。在無血清情況下，細(xì)胞停止增殖，細(xì)胞周期停滯于G1期，而這些細(xì)胞是否分化，各研究結(jié)論是不同的[8－11]，主要是由于研究對(duì)象及所用誘導(dǎo)劑不同的緣故。本研究利用PMA誘導(dǎo)分化U937細(xì)胞，觀察并研究以血清作為調(diào)節(jié)因素情況下，U937細(xì)胞分化成熟及細(xì)胞周期的變化。

研究結(jié)果表明，在有血清培養(yǎng)條件下，經(jīng)10ng／ml PMA作用24小時(shí)后，U937細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生巨大變化，大量細(xì)胞由懸浮變?yōu)橘N壁生長(zhǎng)，細(xì)胞之間由分散狀態(tài)變?yōu)楸舜苏掣綘顟B(tài)，細(xì)胞形態(tài)由圓形變?yōu)槎嘟切位驒E圓形，細(xì)胞周期表現(xiàn)為G1期細(xì)胞明顯增多，S期細(xì)胞明顯減少，并出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。通過細(xì)胞形態(tài)、貼壁率及細(xì)胞周期的改變，可見血清促進(jìn)了細(xì)胞分化成熟，也說明細(xì)胞誘導(dǎo)分化成功。另外細(xì)胞周期測(cè)定結(jié)果顯示，未貼壁細(xì)胞凋亡率明顯高于貼壁細(xì)胞，可能是由于細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后有利于細(xì)胞的存活。本實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定了在正常血清（FCS）、血清加PMA（FCS＋PMA）、無血清（NOFCS）、無血清＋PMA（NOFCS＋PMA）4種情況下細(xì)胞周期的變化，F(xiàn)CS組與NOFCS組相比細(xì)胞周期停滯于G1期。血清恢復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NOFCS＋PMA組細(xì)胞周期仍停滯于G1期，而NOFCS組細(xì)胞周期開始恢復(fù)。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的可能原因有兩個(gè)：一是PMA作用，因?yàn)樵谡麄€(gè)實(shí)驗(yàn)過程中PMA在細(xì)胞體內(nèi)不易代謝，可長(zhǎng)期發(fā)揮作用。所以在血清恢復(fù)后可繼續(xù)發(fā)揮作用；二是據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道在無血清情況下，細(xì)胞CyclinD表達(dá)會(huì)下降，但在血清恢復(fù)后，可能重新恢復(fù)表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)程[12]。

細(xì)胞周期的進(jìn)程主要由兩組相互消長(zhǎng)的蛋白控制即細(xì)胞周期蛋白及細(xì)胞周期依賴性激酶、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白[13]。對(duì)于細(xì)胞周期G1期的停滯可以通過下調(diào)細(xì)胞周期蛋白酶的活性或上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白活性來進(jìn)行調(diào)控。本研究同時(shí)證實(shí)了PMA對(duì)U937細(xì)胞的分化發(fā)揮重要調(diào)控作用，有利于尋找新型抗白血病藥物，但具體的調(diào)控機(jī)制還在進(jìn)一步探討之中。

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