錢文霞+陳麗秀+朱敏鋒+王姝

【摘要】 目的：探討對纖維支氣管鏡活檢小標(biāo)本行流式細(xì)胞儀DNA含量分析對于肺癌診斷的臨床價(jià)值。方法：通過篩選2010年4月-2011年4月于本院呼吸內(nèi)科行纖維支氣管鏡檢患者，以30例肺癌患者及35例肺部良性病變患者為研究對象，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行DNA含量分析，對比分析兩組間DI、異倍體率、SPF、PI的差異，評價(jià)其對于肺癌診斷的臨床價(jià)值。結(jié)果：肺癌患者的DI值、異倍體率、SPF及PI均較肺部良性病變患者顯著升高（P<0.05）；病理組織學(xué)檢查、DNA含量分析、細(xì)胞學(xué)檢查對于肺癌檢測陽性率分別為80.0%、73.3%、43.3%，DNA含量分析、病理組織學(xué)檢查對于肺癌的診斷陽性率顯著高于細(xì)胞學(xué)檢查（P<0.05），而DNA含量分析與病理組織學(xué)檢查結(jié)果無顯著差異（P>0.05）；此外，采用兩者聯(lián)合檢測可進(jìn)一步提高檢出陽性率，可達(dá)90.0%。結(jié)論：肺癌患者腫瘤組織內(nèi)DNA含量顯著高于正常組織，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行DNA含量分析，對于肺癌診斷有一定的臨床價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】 肺癌； 支氣管鏡； 流式細(xì)胞術(shù)； DNA含量分析； 診斷

The Diagnosis Value of DNA Content of the Small Specimens from Bronchoscopic Biopsy on Lung Cancer/QIAN Wen-xia，CHEN Li-xiu，ZHU Min-feng，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（32）：019-021

【Abstract】 Objective：To investigate the diagnosis value of DNA content of the small specimens from bronchoscopic biopsy on lung cancer.Method：30 patients with lung cancer and 35 patients with benign lung disease，which received fiberoptic bronchoscopy，were selected as the research object in our hospital during April 2010 to April 2011， and then DNA content was detected by using flow cytometry to analyze thedifference of DI， aneuploidy rate，SPF，PI between the two groups and to evaluate its clinical value for the diagnosis of lung cancer. Result：The DI，aneuploidy rate，SPF，PI of lung cancer patients were significantly higher than that in the patients with benign lung lesions（P<0.05），the positive rate for lung cancer detection using histopathological examination，DNA content analysis，cytology were 80.0%，73.3%，43.3%，respectively.The positive rate by DNA content analysis and histopathological examination were significantly higher than cytology（P<0.05）， while the DNA content analysis and histopathological examination showed no significant difference（P>0.05）.In addition，the positive rate by combined detection can be further increased up to 90.0%.Conclusion：DNA content in the tumor tissue of lung cancer are significantly higher than that in normal tissue， DNA content analysis by flow cytometry has an important clinical value for the diagnosis of lung cancer.

【Key words】 Lung cancer； Bronchoscopy； Flow cytometry； DNA content analysis； Diagnosis

First-authors address：The Affiliated First Peoples Hospital of Suzhou University in Zhangjiang City，Zhangjiagang 215600，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.32.007

肺癌是較為常見的惡性腫瘤之一，近年來，隨著環(huán)境污染的加劇以及社會(huì)、生活壓力的增加，其發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢，且較難治愈，5年生存率僅為10%～15%[1]。目前，臨床對于肺癌的早期診斷率僅為15%，但經(jīng)早期診斷的患者其5年生存率可達(dá)60%～90%，提示加強(qiáng)肺癌早期診斷，及早救治，對于肺癌患者的治療具有良好的促進(jìn)作用，顯著改善患者預(yù)后，提高其生活質(zhì)量[2-3]。多項(xiàng)研究表明，惡性腫瘤細(xì)胞多表現(xiàn)為染色體異常，如染色體結(jié)構(gòu)改變、數(shù)目減少/增加等，因此，異倍體出現(xiàn)往往惡性腫瘤的特征之一，而染色體的異常也使得腫瘤細(xì)胞內(nèi)DNA含量改變，此外，DNA水平的改變早于細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化發(fā)生，從而使其成為可能的惡性病變早期診斷的指標(biāo)[4-5]。本研究通過篩選2010年4月-2011年4月于本院呼吸內(nèi)科行纖維支氣管鏡檢患者，以30例肺癌患者及35例肺部良性病變患者為研究對象，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行DNA含量分析，對比分析其對于肺癌診斷的臨床價(jià)值。endprint

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年4月-2011年4月于本院呼吸內(nèi)科行纖維支氣管鏡檢的患者356例為研究對象，經(jīng)檢查65例患者疑有支氣管新生物、黏膜病變，后病理組織學(xué)確診發(fā)現(xiàn)，肺癌30例，肺部良性病變35例。其中，30例肺癌患者中，男21例，女9例，年齡43～76歲，平均（62.7±12.3）歲；35例肺部良性病變患者中，男24例，女11例，年齡42～75歲，平均（61.0±10.7）歲。兩組性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 支氣管纖維鏡檢查 纖維支氣管鏡檢查采用日本奧林巴斯公司生產(chǎn)的BF-P40纖維支氣管鏡及成像系統(tǒng)進(jìn)行，具體操作如下：常規(guī)術(shù)前準(zhǔn)備，與患者交流溝通并詳細(xì)掌握患者的臨床資料，如近期X線胸片、CT結(jié)果等，確定患者的病變部位；霧化吸入2%利多卡因行鼻腔、口咽部局部麻醉，經(jīng)鼻腔置入支氣管鏡；于可疑病變處，如支氣管新生物，黏膜僵硬、肥厚、水腫、潰瘍，支氣管外壓性狹窄、閉塞等，即在病變部位選擇3～5處鉗取組織，并在活檢部位刷檢。所取樣本按要求置于含有10%中性福爾馬林、70%乙醇標(biāo)本瓶內(nèi)，分別用于病理檢查及流式細(xì)胞儀檢測[6]。

1.2.2 常規(guī)病理學(xué)檢查 常規(guī)病理學(xué)檢查選取采用10%中性福爾馬林固定的樣本，進(jìn)行脫水及石蠟包埋并切片，厚度約為4 μm，每組樣本切片6～8張，行蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE染色），或采用特異性免疫組織化學(xué)標(biāo)記[7]。所有患者的病理檢查及診斷均由臨床經(jīng)驗(yàn)豐富的同一病理醫(yī)師進(jìn)行，并由另外一位醫(yī)師進(jìn)行復(fù)查，以確保診斷的準(zhǔn)確性。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)DNA含量分析 對于DNA含量分析，儀器選用美國BD 公司生產(chǎn)的FACS Calibur流式細(xì)胞儀，具體操作如下：取支氣管鏡活檢樣本約0.5 g，采用眼科剪將其剪碎至1 mm3大小，180目銅網(wǎng)過濾，PBS緩沖液沖洗，制備單細(xì)胞懸液；1000 r/min離心5 min，除去上清，加入溶血素2 mL重懸細(xì)胞并放置10 min，PBS緩沖液洗滌3次；1000 r/min離心5 min，除去上清，加入95%冰乙醇至終濃度為70%的細(xì)胞懸液固定，待檢。上機(jī)檢測時(shí)，分別依次加入A溶液250 μL（內(nèi)含30 mg/L胰蛋白酶）、B溶液200 μL（內(nèi)含100 mg/LRNase A）、C溶液200 μL，各溶液加入后靜置作用10 min，并調(diào)整細(xì)胞濃度為106。檢測至少收集105個(gè)細(xì)胞，獲取DNA直方圖[8]。

1.3 觀察指標(biāo) DNA含量采用DNA指數(shù)（DI值）表示，DI=（腫瘤細(xì)胞G0/G1峰道數(shù)）/（正常二倍體細(xì)胞G0/G1期峰道數(shù)），根據(jù)DI值的差異判定DNA倍體[9]，其中，0.91.1外，還需觀察DNA直方圖是否出現(xiàn)雙峰及異倍體細(xì)胞群是否含有5%～10%的細(xì)胞或核；測定患者DNA合成期細(xì)胞比率（SPF）及細(xì)胞增殖指數(shù)（PI），以SPF>15%、PI>20%為細(xì)胞增殖異常。其中，SPF（%）=[S÷（G0/G1+S+G2M）]×100%；PI=（S+G2M）/（G0/1+S+G2M）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理分析，其中計(jì)量資料以（x±s）表示，組間對比行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間對比行 字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌及肺部良性病變患者DNA含量分析 對65例疑患有支氣管新生物、黏膜病變者行流式細(xì)胞術(shù)DNA含量分析發(fā)現(xiàn)，肺癌患者的DI值、異倍體率、SPF及PI均較肺部良性病變患者顯著升高，組間對比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），具體見表1。

表1 肺癌及肺部良性病變患者DNA含量分析

2.2 DNA含量分析與病理檢查、細(xì)胞學(xué)檢查的結(jié)果比較 分別采用病理檢查、細(xì)胞學(xué)檢查及流失細(xì)胞儀DNA含量分析進(jìn)行肺癌診斷發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞學(xué)檢查檢出肺癌患者13例，陽性率為43.3%；病理組織學(xué)檢查檢出肺癌患者24例，陽性率為80.0%；DNA含量分析結(jié)果顯示，22例診斷為肺癌，陽性率為73.3%。此外，3例DNA含量分析異常者，經(jīng)病理學(xué)檢查表現(xiàn)為炎性組織，采用兩者聯(lián)合檢測可進(jìn)一步提高檢出陽性率，可達(dá)90.0%。組間對比發(fā)現(xiàn)，DNA含量分析、病理組織學(xué)檢查對于肺癌的診斷陽性率顯著高于細(xì)胞學(xué)檢查， 字2值分別為5.554、8.531，P值分別為0.018、0.003，而DNA含量分析與病理組織學(xué)檢查結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=0.373，P=0.542）。

3 討論

隨著生物學(xué)及醫(yī)學(xué)研究的不斷深入，對于腫瘤細(xì)胞的基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等分子水平研究逐漸明晰，這也使得腫瘤細(xì)胞的診斷方法逐漸增加，腫瘤細(xì)胞DNA含量異常，易出現(xiàn)異倍體。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，91%的惡性腫瘤為異倍體，而良性腫瘤及良性病變細(xì)胞DNA含量多為二倍體，使其成為腫瘤診斷的標(biāo)志物[10]。肺癌是臨床較為常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率較高，且呈上升趨勢，嚴(yán)重威脅患者的生活質(zhì)量和生命安全。研究顯示，早期診斷對于肺癌患者的治療及預(yù)后有著重要作用，可大大提高患者的生存率[11]。因此，如何及早診斷、及早治療肺癌，成為臨床醫(yī)學(xué)亟待解決的重要問題。

有研究報(bào)道，采用流式細(xì)胞術(shù)對肺癌患者的腫瘤組織、正常肺組織及癌旁組織進(jìn)行DNA含量分析發(fā)現(xiàn)，正常肺組織細(xì)胞的DNA含量均為二倍體，而肺癌組織細(xì)胞DNA含量異常，異倍體率高達(dá)74.4%，提示檢測DNA含量，計(jì)算異倍體率可有效檢測肺癌的發(fā)生[12]。譚焰等[13]通過對周圍型肺癌及肺良性病變患者行DNA含量分析發(fā)現(xiàn)，其對于周圍型肺癌的診斷敏感性、特異性分別為67.7%、95.0%，顯著高于較活檢和刷檢的陽性率，表明支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞DNA含量分析能有效診斷周圍型肺癌。本研究通過對支氣管鏡活檢樣本行DNA含量分析發(fā)現(xiàn)，肺癌患者的DI值、異倍體率、SPF及PI均較肺部良性病變患者顯著升高，其異倍體率高達(dá)73.3%，而肺部良性病變患者僅為5.71%，與文獻(xiàn)[12]報(bào)道相符，提示DNA含量增加是惡性腫瘤的特征性指標(biāo)。通過比較組織病理檢查、DNA含量分析及細(xì)胞學(xué)檢查的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三者對于肺癌診斷的陽性率分別為80.0%、73.3%、43.3%，DNA含量分析、病理組織學(xué)檢查對于肺癌的診斷陽性率顯著高于細(xì)胞學(xué)檢查，而兩者間無明顯差異。3例患者病理學(xué)檢查表現(xiàn)為炎性組織而漏診，而DNA含量分析為異倍體，表明DNA含量分析可作為病理學(xué)檢查的輔助項(xiàng)目，用于一些形態(tài)學(xué)檢查難以診斷的病例，從而提高腫瘤診斷效率。

此外，有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織DNA含量、SPF及PI對于腫瘤生物學(xué)行為的改變有重要影響，DI、SPF、PI值越高，患者的生存期越短，SPF、PI值是反映細(xì)胞增殖及侵襲能力的指標(biāo)，其值升高，表示異倍體腫瘤細(xì)胞的增殖活性增強(qiáng)，可在一定時(shí)間內(nèi)可分裂更多次數(shù)，使腫瘤細(xì)胞數(shù)量顯著增加[14-15]。本研究也對比觀察異倍體及二倍體肺癌患者的SPF及PI，異倍體肺癌患者顯著升高。因此，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測DNA含量不僅利于肺癌的早期診斷，同時(shí)可解釋、判斷惡性腫瘤的生物學(xué)行為，有利于預(yù)后判斷。

綜上所述，肺癌患者腫瘤組織內(nèi)DNA含量顯著高于正常肺組織，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行DNA含量分析，對于肺癌診斷有一定的臨床價(jià)值，可作為病理檢查的輔助項(xiàng)目，有效提高肺癌診斷的陽性率，同時(shí)可反映腫瘤的生物學(xué)行為，利于預(yù)后判斷。

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（收稿日期：2014-04-23） （本文編輯：陳丹云）endprint