李霞斌，劉 俊，蔣 堃

乳腺癌是世界婦女發(fā)病率占第一位的惡性腫瘤，近年我國乳腺癌發(fā)病率持續(xù)上升，每年增長3～4個(gè)百分點(diǎn)，并呈明顯的年輕化趨勢［1］。國內(nèi)外專家建議對所有原發(fā)和復(fù)發(fā)乳腺癌標(biāo)本進(jìn)行ER 和PR表達(dá)水平檢測，作為選擇臨床治療方案和輔助內(nèi)分泌治療的依據(jù)。ER 和PR 作為乳腺癌內(nèi)分泌治療療效的重要預(yù)測標(biāo)記，其檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性是臨床選擇治療方案的重要依據(jù)［2-3］。Ki-67 反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性而與乳腺癌輔助治療反應(yīng)有關(guān)［4］。ER、PR及Ki-67的檢測在乳腺癌個(gè)體化內(nèi)分泌治療中的應(yīng)用已成為臨床不可或缺的依據(jù)。

免疫組織化學(xué)法因操作簡便、重復(fù)性好、成本低廉等優(yōu)勢，是目前臨床上廣泛應(yīng)用的檢測技術(shù)。但據(jù)最新資料統(tǒng)計(jì)，目前ER、PR 免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果的假陽性和假陰性率高達(dá)20%［4］。在臨床和回顧性研究工作中我們常遇到一些會診和時(shí)隔幾年后進(jìn)行乳腺癌免疫組化檢測的病例。對于陳舊性乳腺癌石蠟標(biāo)本，按照新鮮蠟塊修復(fù)方法檢測結(jié)果常不理想，有些抗原常檢測不出，或僅呈弱陽性，特別是核抗原。為了給臨床和科研提供真實(shí)可靠的信息，我們對陳舊性乳腺癌標(biāo)本主要核抗原ER、PR、Ki-67 的修復(fù)方法進(jìn)行探索。

1 材料與方法

1.1 檢測組織 隨機(jī)選取瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2010 年1 月～2011 年12 月浸潤性乳腺癌石蠟標(biāo)本120例。

1.2 試劑 兔抗人ER、PR單克隆抗體（克隆號：SP1、SP2，福建邁新），鼠抗人Ki-67 單克隆抗體（克隆號：MIB-1）、即用型Envision檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒、EDTA（pH9.0）抗原修復(fù)液均購于丹麥DAKO公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 石蠟標(biāo)本3μm 連續(xù)切片，60℃烤箱烤片4h，二甲苯脫蠟后梯度酒精至水。切片置于EDTA（pH9.0）抗原修復(fù)液中：（1）高壓修復(fù)：高壓鍋加蒸餾水加熱至沸騰，將切片放入盛修復(fù)液的修復(fù)盒內(nèi)蓋上加壓閥，繼續(xù)加熱至噴氣，分別維持噴氣時(shí)間5、10、15、20min后立刻離開熱源，自然冷卻至室溫。（2）水浴修復(fù)：切片放入盛有修復(fù)液的修復(fù)盒，之后放入沸水浴鍋內(nèi)，修復(fù)30min 后離開熱源，自然冷卻至室溫。3%甲醇雙氧水封閉過氧化物酶10min。一抗室溫孵育3h，二抗室溫孵育30min，DAB顯色、蘇木素復(fù)染。脫水、透明，中性樹膠封片。

1.4 結(jié)果分析 ER、PR 和Ki-67 陽性物質(zhì)均定位于腫瘤細(xì)胞核，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野（40×）計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，采用陽性表達(dá)率半定量分級標(biāo)準(zhǔn)：（1）ER/PR 陽性定義為：＜1%為（-），1%～33%為（1+），34%～66%為（2+），＞66%為（3+）；（2）Ki-67 腫瘤細(xì)胞陽性率＜10%為（-），10%～50%為（1+），51%～75%為（2+），＞75%為（3+）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同修復(fù)時(shí)間對ER、PR 和Ki-67 染色抗原表達(dá)的影響 切片經(jīng)15、20min 高壓修復(fù)和水浴30min修復(fù)后，ER、PR的陽性表達(dá)較理想，細(xì)胞核陽性著色強(qiáng)且背景干凈，細(xì)胞質(zhì)和間質(zhì)中無非特異性著色；著色時(shí)間在20min 組最短，15min 高壓修復(fù)和30min 水浴修復(fù)組著色時(shí)間部分切片稍有延長、染色強(qiáng)度稍有減弱；修復(fù)5、10 min 組ER、PR 部分切片僅組織邊緣有陽性細(xì)胞，陽性著色深淺不一，染色時(shí)間也稍長。Ki-67 抗原的表達(dá)在15、20min 修復(fù)條件下表達(dá)較理想，染色均勻無背景染色；在高壓修復(fù)5、10 min 和水浴30min 的情況下染色均不理想，著色不均勻更明顯，部分腫瘤細(xì)胞染色呈淺黃色，模糊難以判斷。對于修復(fù)時(shí)間＞10min的切片，部分切片的脂肪成分有輕微掉片現(xiàn)象，但腫瘤組織保存較好，不影響結(jié)果判讀。

2.2 不同抗原修復(fù)時(shí)間對癌細(xì)胞ER、PR 和Ki-67 陽性率的影響 隨修復(fù)時(shí)間的延長總陽性率由高到低依次是：20min、15min、水浴30min、10min、5min，且20min 組高級別陽性率最高。ER、PR 在修復(fù)時(shí)間＞15min陽性率明顯提高。Ki-67在高壓修復(fù)15、20min陽性率較水浴30min 及高壓修復(fù)5min、10min 明顯提高。ER、PR、Ki-67在20min組陽性信號強(qiáng)，陽性率最高，與5、10min 組差異有顯著性（P＜0.05），與其余各組比較差異無顯著性（P＞0.05），但高壓20min和水浴30min 比較Ki-67 的表達(dá)較ER、PR 的表達(dá)差異更明顯。經(jīng)不同時(shí)間修復(fù)各指標(biāo)在乳腺癌的陽性表達(dá)，見表1。

表1 ER、PR、Ki-67在不同修復(fù)時(shí)間下的表達(dá)（n=120）

3 討論

組織在固定過程中，經(jīng)甲醛、加熱、有機(jī)溶劑等處理使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)、變性，其抗原決定簇被封閉而無法表達(dá)?？乖瓫Q定簇的充分暴露是決定免疫組織化學(xué)結(jié)果的關(guān)鍵［5］。有研究發(fā)現(xiàn)與空氣接觸的切片在室溫下保存3個(gè)月以上，免疫組化染色結(jié)果會出現(xiàn)減弱或陰性；抗原對多數(shù)抗體的敏感性下降50%，部分切片保存6個(gè)月多數(shù)抗體做不出陽性結(jié)果，尤其核表達(dá)抗原丟失更為突出，其原因可能與氧化作用有關(guān)［6］。對于陳舊性石蠟組織，在保存過程中雖然表面有封蠟，但不是完全的真空狀態(tài)，氧化作用不可避免，可能會導(dǎo)致部分抗原的丟失，特別是淺表組織；同時(shí)存放時(shí)間越長其抗原決定簇被封閉時(shí)間也越長，要將其暴露也越不容易，特別是核抗原的暴露，也許這就是大部分陳舊性蠟塊抗原表達(dá)差的原因之一。

目前認(rèn)為影響核抗原暴露的主要因素有抗原修復(fù)液的pH 值、修復(fù)溫度、壓力、持續(xù)時(shí)間［7］。日常免疫組化工作中對于核抗原，大家逐漸選用高pH 值修復(fù)液進(jìn)行高壓修復(fù)［8］。只有達(dá)到一定的溫度和時(shí)間，抗原暴露充分，染色效果才好。在本實(shí)驗(yàn)中我們均采用pH9.0 的EDTA 修復(fù)液，比較不同高壓修復(fù)時(shí)間之間以及高壓修復(fù)與水浴修復(fù)間的差異，發(fā)現(xiàn)隨著高壓修復(fù)時(shí)間的延長，抗原表達(dá)逐漸增強(qiáng)，20min 的高壓修復(fù)是陳舊性乳腺癌蠟塊主要核抗原表達(dá)的最佳修復(fù)條件；而水浴修復(fù)的時(shí)間雖長，但其效果和短時(shí)間的高壓修復(fù)差不多，對于Ki-67 抗原的表達(dá)尤其明顯。究其原因可能是修復(fù)時(shí)間的延長能使抗原決定簇暴露更加充分，有利于抗原、抗體更好結(jié)合；熱修復(fù)時(shí)間延長還能洗脫部分大分子抗原，降低背景著色［9］。另一方面高壓加熱的溫度可達(dá)到120℃，而水浴修復(fù)在有一定海拔高度的地方很難達(dá)到100℃，組織在120℃的高溫下維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的次級鏈斷裂，產(chǎn)生更多有功能的特征性蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，暴露了更多的抗原結(jié)合點(diǎn)［10］。對于長時(shí)間高溫高壓修復(fù)可能出現(xiàn)的脫片、非特異性背景染色等不良后果，隨著載玻片防脫技術(shù)的不斷改進(jìn)，只有小部分組織有脫片現(xiàn)象，而且隨著抗體和免疫組化檢測系統(tǒng)的不斷優(yōu)化，背景染色也鮮有出現(xiàn)。

不同的抗體其最佳修復(fù)條件存在差異，但是通過摸索可尋求它們的共同最佳修復(fù)條件，在實(shí)際工作中節(jié)省時(shí)間。對于陳舊性乳腺癌石蠟標(biāo)本，我們在日常免疫組化工作中應(yīng)該區(qū)別對待，盡可能的為臨床提供真實(shí)可靠的信息；在科研工作中，也應(yīng)本著求真務(wù)實(shí)的精神，不斷探索最佳實(shí)驗(yàn)條件，提供詳實(shí)的數(shù)據(jù)。通過本實(shí)驗(yàn)，對于存放時(shí)間稍長的乳腺癌石蠟包埋組織，我們認(rèn)為應(yīng)采用EDTA（pH9.0）高壓修復(fù)20min，讓抗原如實(shí)表達(dá)。

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