陳 爽 張慶鎬 方 芳(吉林醫(yī)藥學(xué)院免疫學(xué)教研室，吉林 132013)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性侵蝕性關(guān)節(jié)炎為特征的全身性疾病。其多呈漸進(jìn)型發(fā)展，若不及時(shí)治療，易造成不可逆轉(zhuǎn)的關(guān)節(jié)畸形和強(qiáng)直，致殘率較高。RA的發(fā)病原因尚不明確，環(huán)境和遺傳因素在疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中起共同作用。普遍認(rèn)為類風(fēng)濕是一種自身免疫性疾病，在病人血清中可出現(xiàn)多種自身抗體，如類風(fēng)濕因子(RF)、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(抗CCP抗體)、抗體周因子(APF)、抗角蛋白抗體(AKA)等。在發(fā)病的各種因素中，遺傳因素占50%～60%，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病相關(guān)的易感基因包括HLA-DR、PADI4和PTPN22［1-6］等。易感基因的研究有助于闡明RA的發(fā)病機(jī)制，并可能成為其預(yù)防、治療和預(yù)后控制的重要指標(biāo)。

IL-27是2002年發(fā)現(xiàn)并命名的IL-6/IL-12家族成員，在抗感染抗腫瘤免疫和自身免疫性炎癥等多方面免疫反應(yīng)中起重要作用。目前發(fā)現(xiàn)它與多種炎性疾病與自身免疫病密切相關(guān)，2007年韓國(guó)學(xué)者分析發(fā)現(xiàn)IL-27p28基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的964A＞G位點(diǎn)多態(tài)性與韓國(guó)人群哮喘易感性有關(guān)［7］。2009年有報(bào)道白介素27多態(tài)性與韓國(guó)人炎癥性腸病有關(guān)［8］。在我國(guó)，IL-27p28的-964 G等位基因攜帶可能與鼻咽癌病情嚴(yán)重程度有關(guān)［9］，IL-27基因-964A/G多態(tài)性與大腸癌的發(fā)病具有相關(guān)性［10］。IL-27與慢性乙肝病毒感染感染存在一定的相關(guān)性，A等位基因可能是HBV易感的遺傳因素［11］。為明確對(duì)于中國(guó)漢族人群IL-27p28基因多態(tài)性是否有可能與自身免疫性疾病類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎存在著相關(guān)性，本實(shí)驗(yàn)提取了103名RA患者及104名正常人的全血樣本的基因組DNA，所用樣本均來自中國(guó)東北地區(qū)沒有血緣關(guān)系的人群。采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增目的基因片段，單堿基延伸進(jìn)行目的基因分型，利用病例對(duì)照方法對(duì)所檢測(cè)位點(diǎn)進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 病例組103例，其中男28例，女75例，平均年齡40歲(年齡40～76歲)，病程6個(gè)月～15年，所選個(gè)體均為漢族人群來自吉林市人民醫(yī)院和延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，診斷依據(jù)按美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)1987年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)［12］，臨床資料包括:起病年齡、關(guān)節(jié)腫脹和壓痛數(shù)、畸形關(guān)節(jié)數(shù)、晨僵時(shí)間以及X線檢查和生化檢查指標(biāo)(紅細(xì)胞沉降率ESR，，類風(fēng)濕因子RF，抗CCP抗體)。健康對(duì)照組104例，男43例，女61例，平均年齡57歲(年齡35～71歲)，選自延邊大學(xué)附屬醫(yī)院體檢的人群經(jīng)過血清檢測(cè)RF為陰性，并且無類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的癥狀和體征表現(xiàn)，無自身免疫病家族史，排除感染、腫瘤等疾病。兩組人群性別、年齡均無顯著性差異(P＞0.05)。

1.2 方法 采集外周靜脈血5 ml EDTA抗凝。取2 ml樣本按照外周血基因組DNA提取試劑盒(購(gòu)自北京天根生化公司RelaxGene Blood DNA System，目錄號(hào)DP319-01)說明書提取基因組DNA。DNA樣本分裝后置-20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ锔鶕?jù)Gene Bank上找到的IL-27的基因序列(NC-000016.9)，用軟件primer5.0設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增的包含啟動(dòng)子區(qū)g.964A＞G和外顯子區(qū)g.2905T＞G、g.4730T＞C的3對(duì)引物(由北京益百尚生物技術(shù)公司合成)。g.964A＞G引物序列為5'-CCTCTACAGAGCAGAAACACCA-3'(上游引物)，5'-GGCTCTGTCTCCATCTTTAACC-3'(下游引物)，擴(kuò)增片段的產(chǎn)物長(zhǎng)度377 bp;g.2905T＞G引物序列為5'-CTGGTTCAAGCTGGTGTCTG-3'(上游引物)，5'-CAGCCTTATCCAGGTTCTATCC-3'(下游引物)，擴(kuò)增片段的產(chǎn)物長(zhǎng)度443 bp;g.4730T＞C引物序列5'-GACCTTTCCTGACCATCTCC-3'(上游引物)，5'-ACTCATACAGACCCACATGCAC-3'(下游引物)，擴(kuò)增片段的產(chǎn)物長(zhǎng)度489bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:DNA模板 1 μl，上下游引物各 1 μl，Mix 試劑 10 μl，加滅菌去離子水補(bǔ)足至終體積50 μl。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性 5 min;94℃變性 30 s，60℃退火 1 min，72℃延伸45 s，每個(gè)循環(huán)溫度遞減0.5℃，共10個(gè)循環(huán);94℃變性 30 s，65℃退火1 min，72℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán);72℃延伸3 min，4℃終止反應(yīng)。PCR反應(yīng)試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)呂盛生物技術(shù)公司(通用型PCR試劑盒)。取PCR產(chǎn)物1 μl加緩沖液0.5×TBE，1.0%瓊脂糖凝膠電泳30 min，GoldView染色觀察結(jié)果，分析PCR擴(kuò)增情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 PCR產(chǎn)物純化后應(yīng)用BigDye Terminator v3.1試劑盒，在ABI3730自動(dòng)測(cè)序儀上測(cè)序(由益百尚生物技術(shù)公司完成)?；蛐图暗任换蝾l率用直接記數(shù)法計(jì)算。檢驗(yàn)Hardy-weinberg平衡吻合度(HWE)統(tǒng)計(jì)三個(gè)多態(tài)位點(diǎn)在病例組和對(duì)照組中預(yù)期的基因型頻率，確定所選各組人群是否可以代表中國(guó)漢族群體。應(yīng)用SPSS17.0軟件包采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行差異性比較，檢測(cè)IL-27p28的-964A/G、2905T/G、g.4730T/C三個(gè)位點(diǎn)的基因型頻率與等位基因頻率在病例組及對(duì)照組中是否存在顯著性差異，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增 IL-27p28的三個(gè)位點(diǎn)分別應(yīng)用相對(duì)應(yīng)的3對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。在凝膠成像分析儀下成像，所得PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期的產(chǎn)物一致(圖1)。

2.2 PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果 對(duì)IL-27基因g.964A＞G、g.2905T＞G和g.4730T＞C三個(gè)位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行正向測(cè)序。啟動(dòng)子區(qū)-964位點(diǎn)存在二態(tài)性，在人群中可表現(xiàn)為AA純合型、GG純合型、GA雜合型(圖2)。第二外顯子2905位點(diǎn)也存在二態(tài)性，可表現(xiàn)為TT純合型，GG純合型，TG雜合型，其堿基變化T顛換位G，導(dǎo)致編碼氨基酸由絲氨酸(Ser)變?yōu)楸彼?Alt)(圖3)。第四外顯子區(qū)4730表型僅為TT純合型和TC雜合型，其中T轉(zhuǎn)換為C導(dǎo)致編碼的亮氨酸(Leu)轉(zhuǎn)變?yōu)楦彼?Pro)。

2.3 RA組與對(duì)照組IL-27p28的連鎖不平衡性和SNPs與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性分析 對(duì)103名類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者和104名正常人進(jìn)行檢測(cè)。三個(gè)多態(tài)位點(diǎn)均符合Hardy-weinberg遺傳平衡定律P＞0.05，證明所收集樣本可以代表群體。組間基因型及等位基因的比較運(yùn)用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果三個(gè)位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率的分布在正常對(duì)照組和病例組之間的分布均無顯著性差異(表1)。

圖1 IL-27基因g.2905位點(diǎn)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis result of PCR products on g.2905 site of IL-27 gene

圖2 IL-27p28基因-964A＞G位點(diǎn)PCR產(chǎn)物測(cè)序圖(GG純合型)Fig.2 Sequencing map of IL-27p28(-964A ＞ G)gene PCR products(AG homozygous)

圖3 IL-27p28基因2905T＞G位點(diǎn)PCR產(chǎn)物測(cè)序圖(TG雜合型)Fig.3 Sequencing map of IL-27p28(2905T ＞ G)gene PCR products(TG heterozygous)

圖4 IL-27p28基因g.4730T＞C位點(diǎn)PCR產(chǎn)物測(cè)序圖(TC雜合型)Fig.4 Sequencing map of IL-27p28(4730T ＞ C)gene PCR products(TC heterozygous)

表1 病例組與對(duì)照組基因型及等位基因頻率Tab.1 Genotype and allele frequencies in case and control groups

3 討論

白介素 27(Interleukin-27，IL-27)是 2002年P(guān)flanz等發(fā)現(xiàn)并命名的一種新型IL-12家族細(xì)胞因子，對(duì)不同類型免疫細(xì)胞具有重要調(diào)控作用，尤其在調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞分化與增殖方面具有重要作用［13］。IL-27能協(xié)同IL-12促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，并促進(jìn) Th0 細(xì)胞向 Th1 細(xì)胞分化［14，15］;同時(shí)，IL-27還具有抑制效應(yīng)Th2細(xì)胞功能的作用［16］。而在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中CD4+T細(xì)胞(Th1/Th0細(xì)胞)起重要作用，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的Th1成持續(xù)性活化的高反應(yīng)狀態(tài)。并且已發(fā)現(xiàn)IL-27的增加有利于減輕和緩解關(guān)節(jié)炎［17］。因此，IL-27很有可能成為較好的治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的細(xì)胞因子。

對(duì)于誘因不明的自身免疫性疾病類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有許多易感基因，而IL-27基因多態(tài)性也已發(fā)現(xiàn)出與許多自身免疫病密切相關(guān)，所以本研究考慮IL-27基因多態(tài)性會(huì)不會(huì)與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的易感性相關(guān)?本實(shí)驗(yàn)選取2007年韓國(guó)學(xué)者篩選的IL-27p28基因的4個(gè)單核苷酸多態(tài)(single nucleotide poly-morphism，SNP)位點(diǎn)中的 3個(gè)位點(diǎn)-964A ＞G、2905T＞G、g.4730T＞C，對(duì)其多態(tài)性進(jìn)行研究，通過病例-對(duì)照組研究對(duì)IL-27基因單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行分析。結(jié)果并未檢測(cè)到3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與中國(guó)漢族人群類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎顯著相關(guān)。

分析原因，一方面病例組和對(duì)照組的數(shù)量相對(duì)較少，另一方面收集的樣本均為漢族人群，而基因多態(tài)性與種族、地域等多方面因素均有關(guān)聯(lián)。IL-27的基因多態(tài)性雖然有可能與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的易感性無顯著關(guān)聯(lián)，但I(xiàn)L-27的血清學(xué)變化對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的的調(diào)控和緩解是有顯著的作用的［17，18］，因此IL-27p28很有可能成為治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的新的靶向因子。

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