陳 杰 胡 娜 蘇斌濤 崔天盆(武漢市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430022)

人T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子(T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein，Tim)只有3個(gè)基因，分別為Tim-1、Tim-3和Tim-4，定位于染色體的5q33.2區(qū)域［1］。Tim-1能調(diào)節(jié)T細(xì)胞的增殖，增強(qiáng) Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生［2］，從而調(diào)節(jié)Th1/Th2反應(yīng);Tim-1還可促進(jìn)凋亡細(xì)胞清除以及調(diào)節(jié)B調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)就是一種自身免疫性疾病，SLE患者Tim-1的mRNA表達(dá)水平增高并與疾病的活動(dòng)程度相關(guān)［3］。Kobayashi等［4］在 2007 年報(bào)道Tim-1通過(guò)磷脂酰絲氨酸結(jié)合凋亡的細(xì)胞介導(dǎo)凋亡細(xì)胞的清除，而 SLE患者存在明顯的凋亡紊亂［5］。Tim-1分子第157氨基酸殘基的位置有六個(gè)氨基酸插入的突變157insMTTTVP，即第四外顯子有18個(gè)核苷酸的插入。有該突變的個(gè)體在感染甲型肝炎病毒后不易患過(guò)敏性疾?。?］。SLE與過(guò)敏性疾病一樣是一種免疫功能紊亂性疾病。因此，本文將探討Tim-1第4外顯子插入與缺失多態(tài)性及其血清水平與SLE發(fā)病的關(guān)系，推測(cè)Tim-1在SLE發(fā)病中的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象 系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者92例，女性85人，男性7人。平均年齡41.9歲，范圍從18歲到81歲。全部來(lái)自武漢市第一醫(yī)院就診患者，都符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)2009年的系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷標(biāo)準(zhǔn)。正常對(duì)照來(lái)自健康體檢者。女性76人，男性5人，平均年齡42.3歲，范圍從20歲到75歲。沒(méi)有自身免疫性疾病病史。

1.2 方法

1.2.1 血清的收集 收集受檢者靜脈血3 ml，離心，取血清，-80℃保存?zhèn)溆?/p>

1.2.2 Tim-1蛋白的ELISA檢測(cè) ELISA試劑購(gòu)自R＆D公司。共檢測(cè)健康對(duì)照者中26例，SLE患者中47例。鼠抗人的Tim-1蛋白單克隆抗體用0.05 mol/L pH9.6 Na2CO3-NaHCO3包被緩沖液稀釋至終濃度為 1 μg/ml，空白 96 孔板，每孔加 100 μl，室溫過(guò)夜;棄包被抗體，每孔加封閉液(5%BSA-PBS)100 μl，室溫放置 1 h;棄封閉液，用 1%的 Tween20的PBS洗板三次，一次5 min;加入血清和系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品100 μl，室溫放置1 h;重復(fù)上面洗板步驟;加入稀釋至工作濃度的生物素化的兔抗人的Tim-1蛋白的多克隆抗體100 μl，室溫放置1 h;重復(fù)上面洗板步驟;加入1∶5 000稀釋的鏈霉親和素-HRP結(jié)合物，室溫放置1 h;重復(fù)上面洗板步驟;加入顯色試劑TMB顯色20 min，加入 H2SO4終止顯色反應(yīng)。450 nm測(cè)定OD值。繪制工作曲線，計(jì)算樣本Tim-1蛋白濃度。

1.2.3 模板DNA的提取 使用血常規(guī)采血管收集受檢者靜脈血2 ml，離心，吸取白膜層細(xì)胞。用TIANGEN公司的DNA提取試劑盒(貨號(hào):DP304)提取基因組DNA，溶于TE中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 TIM-1的第4外顯子插入與缺失多態(tài)性分析 自行設(shè)計(jì)一對(duì)引物，上游引物:5'-TCCAGCCTGAGGCTCCTTGTTT-3'，下游引物:5'-ATGCTCATTGTTGTTGGAACAG-3'。缺失型 PCR產(chǎn)物大小是201 bp，插入型是 219 bp。

PCR反應(yīng)體系總體積為25 μl，模板 DNA 100 ng，上下游引物各 1 μl(終濃度為 0.4 pmol/μl)，PCR Marster mix(TIANGEN公司貨號(hào):KT201-02)12.5 μl，用雙蒸水補(bǔ)足反應(yīng)體系的體積。PCR反應(yīng)條件:94℃ 預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸 1 min，30 個(gè)循環(huán)。

PCR產(chǎn)物5 μl，用3%的含GoldviewⅠ瓊脂糖凝膠電泳。伯樂(lè)凝膠成像分析儀(Bio-Rad chemiDocTMXRS+)進(jìn)行拍照。缺失/缺失純合子出現(xiàn)一條201 bp的條帶，缺失/插入雜合子出現(xiàn)201 bp和219 bp的兩個(gè)條帶，插入/插入純合子只出現(xiàn)219 bp的一個(gè)條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示，組間比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。如果方差不齊，采用兩獨(dú)立樣本的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)?；蛐秃偷任换蝾l率經(jīng)哈迪—溫伯格平衡定律檢驗(yàn)，基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 血清中Tim-1蛋白濃度 47例SLE患者和26例健康對(duì)照組血清中Tim-1蛋白濃度分別為(263.083±276.953)和(58.527±92.424)pg/ml。該資料方差不齊，采用秩和檢驗(yàn)(Z=-4.93，P＜0.05)，兩者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Tim-1蛋白濃度在SLE患者中的水平高于健康對(duì)照組。

2.2 不同基因型個(gè)體血清中Tim-1蛋白濃度比較

SLE患者TIM-1的第4外顯子缺失/缺失純合子29例與缺失/插入雜合子18例的Tim-1蛋白的平均濃度分別為(307.360±284.079)和(191.750±256.708)pg/ml，兩組之間無(wú)顯著性差異(t=1.406，P=0.167)。健康對(duì)照組TIM-1的第4外顯子缺失/缺失純合子17例與缺失/插入雜合子8例的Tim-1蛋白的平均濃度分別為(70.295±109.917)和(40.468±41.739)pg/ml，兩組之間無(wú)顯著性差異(t=0.736，P=0.469)。因?yàn)椴迦?插入基因型的個(gè)體數(shù)較少，沒(méi)有進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。該突變沒(méi)有改變Tim-1蛋白在血清中的濃度。

表1 TIM-1外顯子4ins/del基因型和等位基因頻率Tab.1 The exon 4 of TIM-1 ins/del genotype and allele frequencies

圖1 Tim-1第4外顯子ins/del基因分析圖Fig.1 Ins/del polymorphism of the exon 4 of Tim-1 analysis chart

2.2 基因分型結(jié)果圖 缺失/缺失(del/del)純合子出現(xiàn)一條201 bp的條帶，缺失/插入(del/ins)雜合子出現(xiàn)201 bp和219 bp的兩個(gè)條帶，插入/插入(ins/ins)純合子只出現(xiàn)219 bp的一個(gè)條帶，見圖1。

2.3 TIM-1基因的多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的關(guān)系的分析 對(duì)照組和系統(tǒng)性紅斑狼瘡組中，缺失/缺失純合子出現(xiàn)最多，缺失/插入雜合子次之，插入/插入純合子出現(xiàn)最少。經(jīng)HWE平衡檢驗(yàn)，符合哈迪-溫伯格平衡定律，表明該樣本具有抽樣代表性(χ2=0.060，P=0.806)。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，三種基因型組間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.723，P=0.437)。Tim-1此基因多態(tài)性與SLE無(wú)相關(guān)性，見表1。

3 討論

人的 Tim基因有三個(gè)成員:Tim-1、Tim-3和Tim-4。Tim-3和Tim-1表達(dá)于T細(xì)胞表面。Tim-3特異性的表達(dá)在Th1型細(xì)胞上，負(fù)性調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞反應(yīng)。Tim-4表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞，是Tim-1的配體。Tim-4與 Tim-1相互作用，調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化增殖［2］。Tim-1是甲型肝炎病毒的受體［7］，T 細(xì)胞活化共刺激分子。Tim-1分子第157氨基酸殘基的位置有6個(gè)氨基酸插入的突變157insMTTTVP，即第四外顯子有18個(gè)核苷酸的插入。有該突變的個(gè)體在感染甲型肝炎病毒后不易患過(guò)敏性疾?。?］。因此，Tim-1可能參與了免疫系統(tǒng)的調(diào)控，該突變可能改變其功能。

SLE是一種多因素的自身免疫性疾病。機(jī)體會(huì)出現(xiàn)多種自身抗體，補(bǔ)體活化和免疫復(fù)合物沉積，導(dǎo)致組織和多器官損傷。輔助性的T細(xì)胞主要分化成兩型:Th1和Th2。Th1和Th2細(xì)胞功能的失衡在SLE的病理機(jī)制中起了重要作用［8］。Tim-1是活化T細(xì)胞的共刺激分子，大量表達(dá)于CD4+T細(xì)胞上，促進(jìn)Th2型細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)［9］，因此參與Th1和Th2細(xì)胞功能平衡的調(diào)節(jié)。SLE會(huì)產(chǎn)生許多抗核成分的自身抗體，特別是抗染色質(zhì)的自身抗體。由于凋亡的發(fā)生異?；蛘叩蛲黾?xì)胞的清除異常，含有染色質(zhì)的凋亡碎片被釋放。在凋亡的過(guò)程中，這些染色質(zhì)被修飾過(guò)，因此增加了自身的免疫原性。樹突狀細(xì)胞吞噬這些碎片，活化自身反應(yīng)性的T輔助性細(xì)胞，接著活化自身反應(yīng)性的B細(xì)胞，產(chǎn)生自身抗體。被修飾過(guò)的染色質(zhì)與這些自身抗體結(jié)合形成復(fù)合物，沉積在基底膜上，引起炎癥。因此，凋亡細(xì)胞清除障礙是SLE的一個(gè)病因［5］。Tim-1可以結(jié)合磷脂酰絲氨酸，促進(jìn)凋亡細(xì)胞的清除［10］。國(guó)外Xiao等［11］制作一個(gè)Tim-1分子粘蛋白結(jié)構(gòu)域缺失的基因敲除的小鼠，這種突變型的小鼠表現(xiàn)出調(diào)節(jié)性B細(xì)胞分泌IL-10缺陷，這種小鼠隨著年齡的增長(zhǎng)會(huì)自發(fā)系統(tǒng)性自身免疫性疾病，血清中INF-γ和自身抗體的量增加，因此，Tim-1在維持調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的負(fù)性免疫調(diào)節(jié)功能中起很重要的作用［11］。

本實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)92例SLE患者，81位健康對(duì)照個(gè)體，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Tim-1的第4外顯子插入/缺失多態(tài)性與SLE的相關(guān)性。同時(shí)比較不同基因型個(gè)體血清中Tim-1蛋白濃度，發(fā)現(xiàn)該突變不影響血清中其蛋白濃度。這可能是Tim-1此種基因多態(tài)性與SLE無(wú)相關(guān)性的原因。47個(gè)SLE患者和26個(gè)健康對(duì)照組血清中Tim-1蛋白平均濃度分別為263.083±276.953和58.527±92.424 pg/ml，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Wang［3］等報(bào)道SLE患者外周淋巴細(xì)胞表達(dá)Tim-1 mRNA水平增加相對(duì)應(yīng)，我們發(fā)現(xiàn)SLE患者血清中Tim-1蛋白濃度是高于健康對(duì)照組的。適量的Tim-1蛋白結(jié)合磷脂酰絲氨酸，促進(jìn)凋亡細(xì)胞的清除［4］。SLE患者存在凋亡紊亂，SLE外周血淋巴細(xì)胞凋亡增加，且凋亡細(xì)胞與正常細(xì)胞比例與SLE活動(dòng)度呈正比;凋亡細(xì)胞是核小體的重要來(lái)源，而核小體與核小體抗體的結(jié)合，核小體與硫酸軟骨素的結(jié)合是導(dǎo)致狼瘡腎炎的病理生理基礎(chǔ)［5］，腎Tim-1表達(dá)水平高，我們推測(cè)SLE患者凋亡細(xì)胞增加，反饋刺激Tim-1表達(dá)增加，導(dǎo)致血清Tim-1蛋白的升高;最近Xiao［11］等研究發(fā)現(xiàn)Tim-1是調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的表面標(biāo)記之一，SLE患者血清異常增高的Tim-1可能競(jìng)爭(zhēng)性干擾調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的功能，導(dǎo)致SLE病理進(jìn)程加速。

總之，Tim-1蛋白在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清中的濃度升高，可能干擾凋亡清除或/和調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的功能，可能與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的病理生理機(jī)制有關(guān)。有關(guān)具體機(jī)制有待隨后的研究進(jìn)一步證實(shí)。

［1］Rennert PD.Novel roles for TIM-1 in immunity and infection［J］.Immunol Lett，2011，141(1):28-35.

［2］Meyers JH，Chakravarti S，Schlesinger D，et al.TIM-4 is the ligand for TIM-1，and the TIM-1-TIM-4 interaction regulates T cell proliferation［J］.Nat Immunol，2005，6(5):455-464.

［3］Wang Y，Meng J，Wang X，et al.Expression of human TIM-1 and TIM-3 on lymphocytes from systemic lupus erythematosus patients［J］.Scand J Immunol，2008，67(1):63-70.

［4］Kobayashi N，Karisola P，Pena-Cruz V，et al.TIM-1 and TIM-4 glycoproteins bind phosphatidylserine and mediate uptake of apoptotic cells［J］.Immunity，2007，27(6):927-940.

［5］Bouts YM，Wolthuis DF，Dirkx MF，et al.Apoptosis and NET formation in the pathogenesis of SLE［J］.Autoimmunity，2012，45(8):597-601.

［6］Mcintire JJ，Umetsu SE，Macaubas C，et al.Immunology:hepatitis A virus link to atopic disease［J］.Nature，2003，425(6958):576.

［7］Feigelstock D，Thompson P，Mattoo P，et al.The human homolog of HAVcr-1 codes for a hepatitis A virus cellular receptor［J］.J Virol，1998，72(8):6621-6628.

［8］Chen S，Hu D，Shi X，et al.The relationship between Th1/Th2-type cells and disease activity in patients with systemic lupus erythematosus［J］.Chin Med J(Engl)，2000，113(10):877-880.

［9］Nakae S，Iikura M，Suto H，et al.TIM-1 and TIM-3 enhancement of Th2 cytokine production by mast cells［J］.Blood，2007，110(7):2565-2568.

［10］Chen Z，Qing J，Hu L.Interactions of human T cell immunoglobin mucins with apoptotic cells［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2012，32(1):9-16.

［11］Xiao S，Brooks CR，Zhu C，et al.Defect in regulatory B-cell function and development of systemic autoimmunity in T-cell Ig mucin 1(Tim-1)mucin domain-mutant mice［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2012，109(30):12105-12110.