涂 威 向 勤 胡微煦 陳元宜 胡國柱 何 丹 文 珠

(江西省醫(yī)學科學研究院，南昌 330006)

抗原進入致敏機體的呼吸道后刺激其釋放ATP和尿酸激活NLRP3炎癥復合體，裂解IL-1β原產(chǎn)生活性IL-1β，IL-1β再誘導多種炎癥因子產(chǎn)生并引起氣道炎癥，增加 TNF-α mRNA 在氣管中的表達［1，2］。然而抗TNF-α抗體、可溶性TNF-α受體及IL-1受體拮抗劑(IL-1ra)治療哮喘患者及OVA誘導的哮喘模型小鼠和大鼠的療效肯定［3-6］。本研究應用抗IL-1β和TNF-α IgY抗體聯(lián)合霧化吸入治療OVA霧化吸入誘導的過敏性支氣管哮喘模型豚鼠，以期探討其局部治療過敏性支氣管哮喘的可能機制，開辟一種新的治療方法和治療途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級Hartly豚鼠68只，雄性，7周齡，(230±40)g［長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實驗動物科技服務部，生產(chǎn)許可證SCXK(湘)2009-0012］;抗IL-1β和TNF-α IgY抗體(本室制備，IgY純度85%，效價1∶3 200/mg蛋白)。使用重組人IL-1β和TNF-α免疫接種產(chǎn)蛋母雞，收集的雞蛋黃采用水稀釋法提取IgY，兩步硫酸銨鹽析法純化IgY，非還原性SDSPAGE測定IgY純度，免疫酶聯(lián)吸附法(ELISA)測定IgY特異性抗原結(jié)合效價。布地奈德混懸液(1 mg/2 ml，批號 LOT 311385，澳大利亞 AstraZeneca Pty Ltd.);卵清白蛋白(OVA，ovalbumin GradeⅡ，批號A5253，美國 SIGMA 公司);抗豚鼠 IL-1β、IL-4、IL-6、IL-13(批號1106101)、IL-8(批號 1106121)、IL-16(批號 1106102)、TNF-α(批號 1105261)、TGF-β1(批號1105221)、IgE(批號1105205)等 ELISA試劑盒(上海西塘生物科技有限公司)。超聲波霧化吸入器(JSC-202型，遼寧省鞍山市醫(yī)療器械廠);酶聯(lián)免疫檢測儀(Multiskan Ascent型，美國熱電公司)。

1.2 方法

1.2.1 過敏性支氣管哮喘豚鼠模型的建立及實驗分組 過敏性支氣管哮喘豚鼠模型的建立參照文獻［7］。豚鼠適應性飼養(yǎng)1周后將其按隨機數(shù)字表法分為:對照組(C組)15只，模型組(M組)19只豚鼠，1.0%抗TNF-α和IL-1β IgY多克隆抗體治療組(Z1組)18只，布地奈德混懸液治療組(Z2組)16只豚鼠。簡言之，正常對照組(C組)15只，基礎(chǔ)致敏階段(第1、3、5、7日)霧化吸入 0.9%生理鹽水，20 ml/10 min/10只豚鼠/次，連續(xù)霧化4次;加強免疫階段(攻擊)(第15至第25日)霧化吸入0.9%生理鹽水，20 ml/10 min/10只豚鼠/次，連續(xù)霧化11次。過敏性支氣管哮喘模型建立:90只豚鼠隔日(第1、3、5、7日)霧化吸入1.0%OVA生理鹽水溶液，20 ml/10 min/10只豚鼠/次在霧化箱內(nèi)超聲霧化，連續(xù)霧化4次作為基礎(chǔ)致敏，豚鼠致敏30 min內(nèi)出現(xiàn)抓鼻、噴嚏、咳嗽、呼吸加快、口唇紫紺，死亡的豚鼠突然氣絕倒斃或四肢抽搐后死亡，其中致敏階段死亡豚鼠9只;將81只豚鼠經(jīng)背部皮內(nèi)注射25 μl的200 μg/ml卵白蛋白生理鹽水(0.02%OVA)，20～40 min后注射部位出現(xiàn)紅斑和水腫直徑大于1.0 mm的皮丘為致敏成功，其中3只豚鼠致敏不成功(占3.70%);剩余78只豚鼠休息一周又死亡6只;72只豚鼠第15天開始加強免疫(攻擊)(第15至第25日)，每天霧化吸入1.5%OVA生理鹽水溶液，20 ml/10 min/10只豚鼠/次在霧化箱內(nèi)超聲霧化，霧化攻擊6次(第15天至第20天)后又死亡15只豚鼠，將剩余57只豚鼠隨機分成:模型組(M組)(21只)，第21至第25天先霧化吸入1.5%OVA生理鹽水溶液，20 ml/10 min/10只豚鼠/次在霧化箱內(nèi)超聲霧化，然后即刻霧化吸入0.9%生理鹽水，20 ml/10 min/10只豚鼠/次;1.0%抗 TNF-α和 IL-1β IgY多克隆抗體治療組(Z1組)(18只)，第21至第25天先霧化吸入1.5%OVA生理鹽水溶液，20 ml/10 min/10只豚鼠/次在霧化箱內(nèi)超聲霧化，然后即刻霧化吸入1.0%抗TNF-α和IL-1β IgY多克隆抗體溶液，20 ml/10 min/10只豚鼠/次在霧化箱內(nèi)超聲霧化;布地奈德混懸液模型豚鼠治療組(Z2組)(18只)，第21至第25天先霧化吸入1.5%OVA生理鹽水溶液，20 ml/10 min/10只豚鼠/次在霧化箱內(nèi)超聲霧化，然后即刻霧化吸入布地奈德混懸液(1 mg/2 ml)，20 ml/10 min/10只豚鼠/次在霧化箱內(nèi)超聲霧化。最后5 d治療期間M組和Z2組分別死亡2只豚鼠，因此造模成功率為96.67%(87只/90只，死亡豚鼠屬于過敏反應死亡)，豚鼠造模死亡率為39.08%(34只/87只)。所有4組豚鼠于末次治療結(jié)束后(第 25 天)的 2、4、8、24 h、4 個時間點被腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛麻醉，行心臟穿刺取血、支氣管肺泡灌洗及收集BALF。

1.2.2 血漿和支氣管肺泡灌洗及灌洗液采集 豚鼠采用10%水合氯醛(2 ml)腹腔內(nèi)注射麻醉，胸部剖開暴露心臟穿刺取血5～8 ml置EDTA抗凝管中，然后血液涂片染色進行白細胞分類計數(shù)，離心2 000 r/min×10 min取血漿置于－80℃保存。取血后心臟注射空氣處死豚鼠，暴露氣管，在氣管正中做“T”形小切口，插入灌洗針頭并結(jié)扎，向氣管內(nèi)注入生理鹽水2.0 ml反復抽吸并將灌洗液抽出，以1 000 r/min×10 min離心取上清，放置－80℃保存。

1.2.3 細胞染色 將血液細胞滴加于玻片上推片，室溫晾干，滴加美藍固定及染色1～2 min，再滴加伊紅染色10 min，蒸餾水沖洗，室溫晾干;高倍鏡下隨機計數(shù)200個細胞以上，分類計數(shù)。

1.2.4 血漿及支氣管肺泡灌洗液細胞因子測定采用雙抗夾心ELISA法測定血漿和BALF上清中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-13、IL-16、TNF-α、TGF-β1、IgE等，操作按照試劑盒說明書進行，根據(jù)標準曲線計算出各細胞因子的濃度。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用表示。對各組不同時間之間先進行χ2正態(tài)分布和方差齊性檢驗，若符合正態(tài)分布和方差齊性，則采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩組間比較再采用LSD檢驗。若方差不齊兩組之間比較采用Dunnett T3檢驗。相關(guān)性檢驗使用Pearson方法。取P＜0.05表示差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 血液中炎癥細胞含量變化 霧化吸入OVA引起的豚鼠(M組)過敏性支氣管哮喘炎癥在血液中的表現(xiàn)以嗜酸性粒細胞增多為主，其中2 h升高最為顯著，持續(xù)24 h。然而霧化吸入1.0%抗IL-1β和TNF-α IgY(Z1組)在2～8 h，以及激素藥物布地奈德混懸液(Z2組)在2、24 h降低血液中嗜酸性粒細胞數(shù)量。見表1。

表1 各組豚鼠血液中嗜酸性粒細胞比較(，%)Tab.1 Comparison of eosinophils in peripheral blood during different groups(，%)

表1 各組豚鼠血液中嗜酸性粒細胞比較(，%)Tab.1 Comparison of eosinophils in peripheral blood during different groups(，%)

Note:n.Numbers of guinea pig;1)comparation with group C，P ＜0.05;2)comparation with group M，P＜0.05.

Groups 2 h(n) 4 h(n) 8 h(n) 24 h(n)C 1.08±0.27(3)0.75±0.37(4)0.83±0.42(4)1.07±0.96(4)M 8.19±1.881)(5)2.36±0.371)(5)3.13±0.631)(5)2.31±1.321)(4)Z1 2.87±1.472)(4)0.74±0.932)(4)1.63±1.512)(5)1.19±0.87(5)Z2 1.63±0.522)(4)1.70±0.80(4)2.40±0.46(4)0.79±0.292)(4)

2.2 血漿及BALF中炎癥細胞因子含量變化

2.2.1 血漿中炎癥細胞因子含量變化 霧化吸入OVA的過敏性哮喘豚鼠(M組)血漿中炎癥因子僅僅是 IL-16 在 2、4、24 h，TNF-α 在 24 h，TGF-β1 在4、8、24 h顯著高于 C 組。而 IL-1β 在Z1 組4、24 h，IL-16 在 Z1 組2、4、24 h，TGF-β1 在 Z1 組4、8、24 h，以及IgE在Z1組24 h等顯著低于M組(P＜0.05)。見表2。

表2 血漿中炎癥因子含量變化()Tab.2 Content variation of inflammatory cytokines in plasma()

表2 血漿中炎癥因子含量變化()Tab.2 Content variation of inflammatory cytokines in plasma()

Note:n.Numbers of guinea pig;1)comparation with group C，P ＜0.05;2)comparation with group M，P ＜0.05;3)comparation with group Z1，P＜0.05.

TimeGroups n IL-1β(pg/ml)IL-4(pg/ml)IL-6(pg/ml)IL-8(pg/ml)IL-13(pg/ml)IL-16(pg/ml)TNF-α(pg/ml)TGF-β1(pg/ml)IgE(ng/ml)147.27±199.50 211.43±14.35 M 4 18.97±2.53 137.23±23.33 4.61±3.00 41.69±11.80 19.64±6.05 27.33±5.44 1)281.35±14.92 13 996.66±265.49 237.52±27.32 Z1 4 62.34±87.26 205.16±58.28 4.81±1.93 56.53±15.24 7.50±1.66 17.75±4.582)264.68±11.68 14 417.57±5 202.91 278.24±21.21 Z2 4 53.27±19.28 466.52±428.81 4.71±2.22 86.52±57.84 17.59±18.8453.26±9.001)2)3)436.73±349.72 9 225.42±1 076.43 198.59±25.52 4 h C 4 14.70±1.45 319.45±232.62 4.11±2.71 60.52±36.91 19.59±23.46 12.24±3.21 340.19±246.06 11 194.94±10 29.68 262.98±102.79 M 4 18.29±2.07 125.14±26.01 4.62±1.31 40.12±8.43 8.64±1.81 27.85±3.871)272.72±13.65 14 413.86±332.581)268.92±39.34 Z1 4 8.74±1.921)2)246.76±131.04 3.66±1.01 33.82±9.15 7.55±1.11 8.50±2.152) 351.48±174.38 12 193.71±191.042)252.84±48.39 Z2 4 16.24±1.90 209.32±53.11 3.41±3.06 39.93±8.20 6.04±5.89 17.03±2.342)3)248.42±25.8113 969.72±1195.781)2)240.30±22.79 8 h C 4 12.73±5.06 202.78±32.81 1.96±1.95 41.95±17.40 9.81±5.31 21.21±17.60 213.48±26.41 10 914.63±688.72 252.13±62.09 M 4 17.28±2.32 126.40±18.381)4.17±2.01 41.10±18.66 9.33±2.43 29.84±5.47 274.58±23.99 14 259.20±240.671)263.94±32.95 Z1 4 14.91±6.93 131.79±29.26 2.77±1.98 36.92±10.71 9.23±3.71 25.67±12.27 228.89±67.45 10 077.51±890.042)364.63±129.12 Z2 4 6.95±4.971)151.76±88.58 1.04±1.162)37.94±17.68 4.55±1.85 22.10±11.03 160.55±71.402)8588.33±1037.981)2)3)142.52±76.492)24 h C 4 18.29±6.77 244.23±79.69 2.54±1.59 53.82±24.73 14.76±1.95 12.73±4.35 255.20±57.23 10 219.84±419.73 219.05±25.46 M 4 19.02±1.18 124.31±25.31 4.36±1.31 40.47±11.57 12.17±4.29 28.24±4.161)271.78±18.101)14 638.11±274.871)256.13±18.66 Z1 4 11.22±3.121)2)168.37±75.03 1.74±0.92 31.95±16.54 8.59±3.13 12.91±2.652)254.13±32.14 6 970.94±2723.032)170.85±29.101)2)Z2 4 13.10±4.70 274.19±102.29 2.46±1.45 53.96±18.51 10.75±1.49 14.24±3.462)444.58±365.40 7 889.74±933.661)126.71±52.021)2)2 h C 3 14.37±2.24 173.35±26.25 2.92±2.68 45.64±8.10 8.97±2.89 11.88±5.65 214.65±13.83 10

2.2.2 BALF中炎癥細胞因子含量變化 霧化吸入OVA的過敏性哮喘豚鼠(M組)BALF中炎癥因子 IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-13、IL-16、TNF-α、TGF-β1、IgE在2～24 h期間較C組顯著增加(P＜0.05)。僅僅是IL-1β和TNF-α在 Z1組2～8 h顯著低于M 組(P ＜0.05)。然而IL-4、IL-6、IL-8、IL-13在Z1組4～24 h，TGF-β 和 IgE 在 Z1組4～8 h，IL-16在 Z1組8 h等顯著低于M組(P＜0.05)見表3。BALF中炎癥因子有意義地變化是IL-1β和TNF-α首先降低，然后是其他因子下降，這表明過敏性炎癥反應中IL-1β和TNF-α可能是始動因子。

表3 支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子含量變化()Tab.3 Content variation of inflammatory cytokines in bronchoalveolar lavage fluid()

表3 支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子含量變化()Tab.3 Content variation of inflammatory cytokines in bronchoalveolar lavage fluid()

Note:n:Numbers of guinea pig;1)comparation with group C，P ＜0.05;2)comparation with group M，P ＜0.05;3)comparation with group Z1，P＜0.05.

Time Group n IL-1β(pg/ml)IL-4(pg/ml)IL-6(pg/ml)IL-8(pg/ml)IL-13(pg/ml)IL-16(pg/ml)TNF-α(pg/ml)TGF-β1(pg/ml)IgE(ng/ml)±21.27 6.06±1.01 M 4 6.35±0.801)51.62±3.171)5.30±1.94 47.07±6.331)4.76±0.651)60.61±9.731) 65.13±1.301) 1 348.39±29.48 11.52±1.031)Z1 4 4.82±0.601)2)54.92±7.381)4.12±1.29 46.26±4.651)5.37±0.761)66.42±18.181)57.20±3.312) 1 365.39±60.531) 11.52±2.441)Z2 4 4.45±0.881)2)41.10±2.821)2)3)3.13±0.88 38.19±9.031)4.52±0.371)3)53.47±17.68 71.67±7.371)3)1 268.70±67.372) 10.51±0.671)4 h C 3 3.05±0.06 33.03±2.80 3.44±0.63 25.24±5.41 3.17±0.82 34.23±6.58 57.39±2.86 1 251.79±25.55 6.06±0.80 M 4 6.56±1.061)56.20±2.651)5.35±0.871)48.72±9.331)4.82±0.691)63.29±6.151) 63.30±3.04 1 365.28±31.171) 11.20±0.551)Z1 4 2.32±0.852)35.38±4.442)3.66±0.862)25.54±4.222)3.45±0.782)48.28±18.08 56.70±3.242) 1 208.34±11.892) 9.30±1.121)2)Z2 4 3.37±0.701)30.15±6.652)2.93±0.912)28.69±6.722)3)3.05±0.472)33.52±7.562) 48.34±3.662) 1 280.78±88.68 8.06±0.901)2)8 h C 4 3.64±0.93 34.47±5.56 3.17±9.86 24.26±5.58 3.24±0.23 31.70±8.31 51.61±3.04 1 232.46±43.24 6.63±1.06 M 4 6.28±0.661)50.16±4.281)5.18±0.911)48.72±8.301)4.49±0.551)58.60±3.871) 67.96±2.011) 1 329.07±33.711) 10.47±0.791)Z1 4 3.17±0.562)30.00±4.322)2.82±1.022)27.70±3.232)2.65±0.472)28.45±4.172)55.13±10.602)1 191.43±71.252) 7.32±1.102)Z2 4 1.28±0.651)2)3)29.49±2.572)1.65±0.841)2)22.31±6.682)2.58±0.371)2)30.39±10.352)54.44±9.572) 1 167.29±25.992) 7.02±1.382)24 h C 4 3.49±0.90 36.12±4.02 3.88±0.85 27.87±6.79 3.34±0.59 32.44±7.02 53.87±2.89 1 300.09±138.13 6.59±0.86 M 4 6.51±0.651)52.28±4.281)5.18±1.211)46.56±6.081)4.51±0.661)53.49±6.561) 61.74±4.671) 1 367.70±68.26 11.11±1.101)Z1 3 6.12±1.651)39.09±11.062)2.58±0.681)2)35.73±5.442)3.01±0.872)45.83±22.03 63.62±6.211) 1 416.00±303.08 9.46±1.971)Z2 4 3.75±0.972)3)37.44±11.032)3.23±0.761)2)32.63±7.572)2.46±0.492)3)35.91±4.552)70.54±5.691)2)3)1 191.44±14.492) 7.73±0.882)2 h C 3 3.16±0.79 32.35±3.67 3.54±1.38 27.37±3.63 3.15±0.21 39.46±5.26 56.72±2.80 1 280.77

2.3 血漿及BALF中炎癥細胞因子相關(guān)性 在血漿中 IL-1β 與 IL-4、IL-8、IL-16、TNF-α 等呈正相關(guān)(P ＜ 0.05)，以及 TNF-α 與 IL-6、IL-16、TGF-β、IgE等呈正相關(guān)(P＜0.05)。在BALF中，IL-1β與IL-4、IL-6、IL-8、IL-13、IL-16、TNF-α、TGF-β1、IgE 等呈正相關(guān)(P ＜0.05)，以及 TNF-α 與 IL-1β、IL-4、IL-8、IL-13、IL-16、IgE 等呈正相關(guān)(P ＜0.05)。

3 討論

豚鼠經(jīng)OVA致敏4次平滑肌收縮不斷增強，攻擊1小時BALF中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞增加，直至24 h增加 3～44倍;TNF-α、IL-4、IL-5也增加［8-10］。我們現(xiàn)在與以往的研究［7］都證明霧化吸入OVA致敏和攻擊的豚鼠出現(xiàn)典型的過敏性病理反應，并且現(xiàn)在也證明血液嗜酸性粒細胞增加，以及血液和BALF中Th2細胞因子及炎癥因子升高。OVA誘導的哮喘模型大鼠血清IgE濃度升高，而每次激發(fā)之前30 min靜脈注射 IL-1ra使之顯著降低［6］。本文霧化吸入OVA致敏和攻擊的豚鼠血液中以嗜酸性粒細胞顯著增加為主，但在霧化吸入1.0%抗IL-1β和TNF-α IgY治療后在2～8 h明顯降低，且與布地奈德激素治療組無顯著性差異(見表1)。本文過敏性哮喘豚鼠血液中 IL-16、TNF-α、TGF-β 在不同時間點顯著高于正常對照組，然而經(jīng)1.0%抗IL-1β 和 TNF-α IgY 治療后 IL-1β、IL-16、TGF-β 和IgE等在不同時間點顯著低于M組，且與布地奈德激素治療組相似(見表2)。本文豚鼠模型為霧化吸入OVA致敏和攻擊模型，氣道和肺泡等肺組織以局部過敏反應為主，這可能更符合吸入性過敏反應的患者的實際情況，因此豚鼠血液中炎癥細胞數(shù)量和炎癥細胞因子變化較其他學者采用的皮下或腹腔注射OVA全身過敏性反應模型不同，后者血液中炎癥細胞數(shù)量和炎癥細胞因子變化更為顯著。

OVA致敏/攻擊的豚鼠 BALF中 TNF-α、IL-4、IL-5和嗜酸性粒細胞升高［8］，攻擊1 h嗜酸性粒細胞、中性粒細胞就增加，24 h嗜酸性粒細胞增加3～44倍，而中性粒細胞下降至正常［9］。布地奈德吸入均可抑制OVA致敏/攻擊的豚鼠BALF中嗜酸性粒細胞和中性粒細胞，以及 TNF-α、IL-4、IL-5的增加［9］。OVA致敏/攻擊的小鼠靜脈注射抗TNF-α抗體(Infliximab)后BALF中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、TNF-α、IL-6 減少［3］，而腹腔注射可溶性 TNF 受體(sTNFR)也減少了BALF中嗜酸性粒細胞、IL-4、IL-5、IL-13［4］。OVA 攻擊大鼠前 30min 靜脈注射IL-I受體拮抗劑(IL-1ra)其BALF中嗜酸性粒細胞百分比下降［6］。本文豚鼠霧化吸入OVA后BALF中 IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-13、IL-16、TNF-α、TGF-β1、IgE在2～24 h期間顯著增加(M組)，但有趣的是1.0%抗IL-1β和TNF-α IgY抗體霧化吸入治療后BALF中炎癥因子IL-1β和TNF-α首先下降(2 h)，而其他Th2細胞因子和炎癥因子，如IL-4、IL-6、IL-8、IL-13 則在4～ 24 h，TGF-β、IgE 在4～8 h，IL-16在8 h期間顯著下降;當IL-1β和TNF-α在24 h上升時，而 IL-4、IL-6、IL-8、IL-13在24 h仍顯著下降;并且 IL-1β 與 IL-4、IL-6、IL-8、IL-13、IL-16、TNF-α、TGF-β1、IgE，以及 TNF-α 與 IL-1β、IL-4、IL-8、IL-13、IL-16、IgE等呈正相關(guān)。這一現(xiàn)象初步證明IL-1β和TNF-α是過敏性哮喘免疫效應階段炎癥發(fā)生、發(fā)展的始動炎癥因子。其他學者的研究也證明IL-1β加入氣管培養(yǎng)中刺激氣管上皮細胞表達IL-1R1和TNFR1及平滑肌細胞表達TNFR1增加，并仍可刺激氣管上皮細胞及平滑肌細胞本不表達的TNFR2表達［11］。IL-1β 增加 TNF-α mRNA 在氣管中的表達，而抗TNF-α抗體顯著抑制了IL-1β誘導的緩激肽B1和B2受體在氣道平滑肌上表達［3］，這也證明IL-1β可能在炎癥發(fā)展過程中出現(xiàn)在TNF-α之前。

本研究還證明抗IL-1β和TNF-α IgY霧化吸入治療OVA誘導的過敏性哮喘豚鼠的療效與布地奈德治療無顯著差異(見表1～3)。這一結(jié)論可能有利于抗IL-1β和TNF-α IgY霧化吸入治療過敏性哮喘患者，因為特異性IgY被動免疫治療可以達到良好的局部治療的效果，同時不引起像激素治療所產(chǎn)生的全身不良反應等毒副作用。事實上，一項長達十年的特異性抗綠膿桿菌IgY口服預防肺囊性纖維化患者綠膿桿菌感染的試驗證明，IgY治療未見毒副作用，且療效明確［12］。本研究還提示，抗 IL-1β和TNF-α IgY抗體霧化吸入局部治療可能是一種新的有效治療過敏性哮喘的手段和途徑。

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