高騰飛 古彥錚 徐俊馳 沈 宇 李曉晨 朱一蓓 張學光

(蘇州大學醫(yī)學部基礎(chǔ)醫(yī)學與生物科學學院，蘇州 215013)

腫瘤的過繼細胞免疫治療(Adoptive cellular immunotherapy，ACI)是繼腫瘤的手術(shù)治療、放療、化療后的第四種治療方式，并日受到重視［1］。主要原理是采集腫瘤患者外周血中單個核細胞、經(jīng)細胞因子誘導、擴增出一定數(shù)量的具有腫瘤殺傷能力的細胞，再回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)［2］。其中細胞因子誘導的殺傷性細胞(CIK)在培養(yǎng)過程中細胞增殖速度快、具有一定的殺傷腫瘤活性、對多種耐藥腫瘤細胞均較為敏感［3］，在當今腫瘤的過繼細胞免疫治療中被廣泛應(yīng)用。它的主要效應(yīng)細胞是CD3+CD56+細胞［4］。但是CIK細胞在治療中存在一定不足，所以臨床療效達不到預(yù)期的結(jié)果。本實驗建立一種新的過繼免疫細胞誘導方案:CD40激發(fā)型單抗5C11聯(lián)合細胞因子IFN-α、IL-7和IL-2(CD40激發(fā)組)體外制備過繼免疫治療細胞，并與常規(guī)CIK(CD3激發(fā)組)進行對比性分析，為臨床腫瘤過繼免疫治療提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 標本來源 在蘇州大學附屬第一醫(yī)院收集正常人外周血來源的PBMC，標本征得本人及其家屬同意，并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 抗人CD3單克隆抗體(OKT-3)、IL-2、IFN-γ、IL-1α、IL-7 和 IFN-α 均購自美國的 PeproTech公司;激發(fā)型CD40抗體來自本研究所研制，克隆號為5C11;淋巴細胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司;小牛血清、RMPI1640培養(yǎng)基購自美國 Hyclone公司;CD56-FITC、CD3-PE、CD4-PE-Cy7、CD8-PE-Cy5、CD14-PE、CD11c-PECy5、CD25-PE-Cy5和Foxp3-FITC熒光抗體均購自美國eBioscience公司;Foxp3檢測試劑盒購自美國eBioscience公司。

1.3 過繼免疫治療細胞體外擴增培養(yǎng)及形態(tài)觀察

將PBMC細胞用RMPI1640完全培養(yǎng)基(含10%小牛血清)配成細胞懸液，然后轉(zhuǎn)入6孔板(5.0×106/孔)和24孔板(3.0×105/孔)里，然后于各組細胞培養(yǎng)液中加入相應(yīng)細胞因子:CD3激發(fā)組起始時(即第0天)加入 IFN-γ(1 000 U/ml)，24 h后再加入 IL-2(1 000 U/ml)、IL-1α(100 U/ml)和抗CD3mAb(50 ng/ml);CD40激發(fā)組起始時(即第0天)加入5C11(2 μg/ml)，IL-7(10 ng/ml)，IFN-α(5 ng/ml)，IL-2(300 U/ml)。然后將培養(yǎng)板放到37℃、5%CO2、飽和濕度95%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。之后，視細胞狀態(tài)每隔2～3 d即每3 d補一次細胞因子液，其中CD3激發(fā)組僅補加IL-2(1 000 U/ml)，而CD40激發(fā)組則補加全部4種細胞因子5C11(2 μg/ml)、IL-7(10 ng/ml)、IFN-α(5 ng/ml)和 IL-2(300 U/ml)。每天觀察，并拍照記錄。

1.4 CD3激發(fā)組和CD40激發(fā)組細胞增殖情況分析 在細胞培養(yǎng)的第6、9、12天收集適量細胞，臺盼藍染液(10 μl)以1∶1混合均勻，在 3 min 內(nèi)，分別計數(shù)活細胞和死細胞，鏡下觀察，死細胞被染成明顯的藍色，而活細胞拒染呈無色透明狀，最后按照公式:(細胞懸液的細胞數(shù))/ml=(四個大格子細胞數(shù)/4)×稀釋倍數(shù)×104統(tǒng)計活細胞數(shù)量。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞免疫表型 在第9天分別收集CD3激發(fā)組和CD40激發(fā)組培養(yǎng)的過繼免疫治療細胞。①T細胞、NKT細胞和Mo-NK-DC細胞組成的流式檢測:加入適量的FITC、PE、PE-Cy5或者PE-Cy7熒光素標記的混合抗體，包括 CD56、CD3、CD4、CD8、CD14 和 CD11c，震蕩，4℃避光孵育30 min，加入適量PBS 洗滌，震蕩，1 500 r/min，5 min離心，棄上清液，加入500 μl PBS，流式細胞儀機器上檢測。②Treg細胞組成的流式檢測:應(yīng)用Foxp3檢測試劑盒，在加入CD4-PE和CD25-PE-Cy7熒光素標記的混合抗體并4℃避光孵育30 min后，使用固定劑4℃避光孵育90 min，然后使用破膜劑同時加入Foxp3-FITC熒光素標記的抗體，4℃避光孵育30 min，最后經(jīng)過同①的方法處理后流式細胞儀機器上檢測。③數(shù)據(jù)文件使用Flowjo軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 體外擴增的過繼免疫細胞的形態(tài)學觀察 體外培養(yǎng)細胞形態(tài)觀察顯示，CD3激發(fā)組和CD40激發(fā)組細胞均出現(xiàn)明顯的集落樣增殖，CD3激發(fā)組的集落較大，而CD40激發(fā)組的集落要略小而密，但二者在形態(tài)上無明顯差異，均表現(xiàn)為胞體和胞核增大，胞漿增多，漿中出現(xiàn)顆粒、空泡等特征(見圖1)。

2.2 兩組過繼免疫細胞增殖速率的動態(tài)比較 本實驗使用24孔板體外培養(yǎng)過繼免疫治療細胞，起始接種量為3.0×105/孔，在培養(yǎng)的第6、9、12天使用臺盼藍法對培養(yǎng)的過繼免疫治療細胞進行活力計數(shù)，發(fā)現(xiàn)CD3激發(fā)組的細胞增殖速度略快于CD40激發(fā)組(見圖2)。體外培養(yǎng)第12天時，CD3激發(fā)組的細胞的數(shù)量達到了接種時的24倍左右(3.0×105～7.12×106)，這與經(jīng)典的過繼免疫治療細胞增殖速度(細胞數(shù)量平均增加25倍)一致，而CD40激發(fā)組培養(yǎng)的過繼免疫治療細胞到第12天時，細胞的數(shù)量達到了接種時的20倍左右。

圖1 CD3激發(fā)組和CD40激發(fā)組的細胞形態(tài)學觀察Fig.1 Cell morphology of CD3 and CD40 agonist groups

圖2 CD3激發(fā)組和CD40激發(fā)組的細胞增殖曲線圖Fig.2 Cell growth curve of CD3 and CD40 agonist group

圖3 CD3激發(fā)組和CD40激發(fā)組的T淋巴細胞的表達情況Fig.3 Expression of T lymphocyte in CD3 and CD40 agonist group

圖4 CD3激發(fā)組和CD40激發(fā)組的CD3+CD56+細胞的表達情況Fig.4 Expression of CD3+CD56+cells in CD3 and CD40 agonist group

圖5 CD40激發(fā)組的Treg細胞比例顯著低于CD3激發(fā)組Fig.5 Treg cell percentage of CD40 agonist group is significantly lower than of CD3 agonist group

2.3 CD3激發(fā)組和CD40激發(fā)組的T淋巴細胞亞群分析 在培養(yǎng)的第9天收集培養(yǎng)的過繼免疫治療細胞，檢測其CD3+CD4+T和CD3+CD8+T細胞群體的變化狀況。結(jié)果顯示，CD3激發(fā)組的 CD3+CD4+T和CD3+CD8+T細胞比例分別在(42.8%±7.56%)和(52.6% ±8.34%)左右，而CD40激發(fā)組的CD3+CD4+T和CD3+CD8+T細胞頻率分別在(44.3% ±9.45%)和(48.7% ±6.18%)左右，兩組間無顯著差異(P＞0.05，見圖3)。

2.4 CD40激發(fā)組的NK-T(CD3+CD56+)細胞比例顯著高于CD3激發(fā)組 在培養(yǎng)的第9天收集過繼免疫治療細胞，檢測其CD3+CD56+細胞群體的變化狀況。結(jié)果顯示，CD3激發(fā)組的CD3+CD56+細胞比例為(15.3% ±4.12%)，CD40激發(fā)組的CD3+CD56+細胞比例為(25.6% ±5.34%)，兩組之間存在顯著差異(P＜0.05，見圖4)。

2.5 CD40激發(fā)組的Treg細胞比例低于CD3激發(fā)組 在培養(yǎng)的第9天收集過繼免疫治療細胞，檢測其Treg細胞的變化。結(jié)果顯示，CD40激發(fā)組過繼免疫治療細胞中Treg細胞的頻率顯著低于CD3激發(fā)組，兩組有顯著差異(P＜0.05，見圖5)。

2.6 CD40激發(fā)組出現(xiàn)獨特的Mo-NK-DC樣細胞群體 在培養(yǎng)的第9天收集培養(yǎng)的過繼免疫治療細胞，檢測其 CD14+CD56+和 CD56+CD11c+細胞的變化狀況。結(jié)果顯示，CD40激發(fā)組培養(yǎng)的過繼免疫治療細胞中出現(xiàn)一群特殊的Mo-NK-DC樣細胞群體，而在CD3激發(fā)組幾乎未出現(xiàn)(見圖6)。

圖6 CD40激發(fā)組出現(xiàn)獨特的Mo-NK-DC樣細胞群體(CD14+CD11c+/CD56+CD11c+)Fig.6 There occurs an unique set of Mo-NK-DC like cell group in CD40 agonist group(CD14+CD11c+/CD56+CD11c+)

3 討論

惡性腫瘤是嚴重危害人類健康的重要疾病之一。目前，手術(shù)、放療和化療仍是主要的治療手段，但各種原因都可導致疾病的復(fù)發(fā)，以致死亡率甚高。過繼細胞免疫治療(ACI)正成為當今繼放化療后治療惡性腫瘤的一種新的治療手段，主要通過取自體或異體免疫細胞，在細胞因子誘導下大量擴增具有抗腫瘤活性的淋巴細胞回輸給腫瘤病人，介導患者的抗腫瘤免疫力［5］。

雖然常規(guī)以 CD3McAb聯(lián)合細胞因子 IL-2，IFN-γ，IL-1α誘導的CIK細胞治療是目前最為常用的方案，但存在著一些亟待解決的療效不佳問題:由于用大劑量IL-2維持后期T細胞的增殖，大劑量IL-2會誘導一定數(shù)量的調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)［6］，這可能是影響CIK療效的關(guān)鍵因素。鑒于常規(guī)CIK培養(yǎng)方案的不足，尋找更為有效的過繼免疫細胞體外誘導方案始終是腫瘤免疫研究的熱點。

CD40信號是抗原提呈細胞(APC)的分化及功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)途徑［7］;CD40信號激發(fā)可增強單核細胞和樹突狀細胞(DC)的生存能，促進單核細胞的殺瘤活性［8，9］，以致對T細胞和APC細胞的功能均產(chǎn)生重要影響［10］。IFN-α 可提高 CD4+T細胞、CD8+T細胞和 NK細胞對 IFN-γ的表達，并平衡Th1/Th2免疫應(yīng)答［11］;IFN-α還能有效地擴增CD8+T細胞，提高其細胞活性［12］;還有研究發(fā)現(xiàn)，IFN-α還可以促進DC細胞的活化和增加NK細胞的細胞毒性［13］，因此被用于抗病毒感染和癌癥免疫治療中。研究表明，IL-7能刺激初始和記憶淋巴細胞增殖，同時IL-7協(xié)同促進T細胞成熟，向Th1細胞分化，抑制細胞凋亡［14］;IL-7對淋巴細胞的各個亞群包括CD8+和CD4+T細胞、調(diào)節(jié)性T細胞和記憶性T細胞等均有促進增殖、活化和調(diào)節(jié)作用。已有研究顯示，IL-7正逐漸成為腫瘤免疫應(yīng)答和腫瘤免疫治療研究的熱點之一［15］。

本研究顯示，盡管CD40激發(fā)組的細胞增殖數(shù)量略低于CD3激發(fā)組，但是這對要求數(shù)量的過繼免疫治療回輸細胞沒有影響。衛(wèi)生部“人體細胞治療臨床研究質(zhì)控要點”和中國免疫學會制定的“過繼性免疫治療癌癥規(guī)范”規(guī)定每例患者需平均治療2個療程，每療程回輸細胞總數(shù)應(yīng)不少于5×109個［16］，通過血細胞分離儀采集的 PBMC，完全能達到治療要求的數(shù)量，我們只需在培養(yǎng)前根據(jù)需要取足量PBMC即可。

我們研究發(fā)現(xiàn)，與CD3激發(fā)組相比，CD40激發(fā)組體外誘導的過繼免疫細胞中，Treg比例明顯下降，而CD3+CD56+NKT細胞比例顯著增加，并且培養(yǎng)細胞群體里出現(xiàn)一群新的細胞群體，即表達CD14、CD56和CD11c分子的Mo-NK-DC樣細胞，這群細胞的生物學特性和功能也有待探討。綜上所述，本研究通過CD40單克隆抗體聯(lián)合細胞因子IFN-α和IL-7能有效擴增過繼免疫細胞，降低Treg細胞比例同時提高了抗腫瘤能力的NKT細胞，該方法可能為腫瘤細胞過繼免疫治療提供又一嶄新的途徑。

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