趙穎杰 王吉波 辛苗苗 梁宏達 劉相萍 楊 堃 隋愛華

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，青島 266003)

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是雙鏈RNA 介導(dǎo)的、序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默［1，2］，為基因治療的方法之一。實施RNAi基因治療的關(guān)鍵為載體選擇，慢病毒載體具有表達時間長、低免疫原性、低細(xì)胞毒性且能有效轉(zhuǎn)染包括單核巨噬細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、胰腺細(xì)胞等多種難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系［3-8］。TNF-α 是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)的重要致炎因子［9］。因而本文構(gòu)建靶向小鼠 TNF-α基因的RNAi慢病毒顆粒，為靶向TNF-α的 RNAi實驗性基因治療RA提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 siRNA設(shè)計與合成 以Genbank數(shù)據(jù)庫中的小鼠TNF-α基因 mRNA序列(NM_013693)，根據(jù)siRNA設(shè)計原則［10］，按美國Ambion公司網(wǎng)站提供的siRNA Target Finder進行siRNA設(shè)計。為避免脫靶效應(yīng)［11］，siRNA序列需經(jīng)BLSAT分析以排除同源序列，陰性對照序列參照文獻［12-14］。具體序列見表1。siRNA由上海吉瑪公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與基因轉(zhuǎn)染 小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞庫)用含10%胎牛血清(Gibco)DMEM培養(yǎng)基(Gibco)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。RAW264.7細(xì)胞以8×104個/孔的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞融合達40%左右行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。siRNA終濃度為100 mol/L［15］。轉(zhuǎn)染操作按照X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent(Roche)操作手冊進行。實驗設(shè)3組對照:等體積培養(yǎng)液空白對照組、轉(zhuǎn)染試劑對照組及陰性對照組。每組設(shè)重復(fù)孔3個。siRNA轉(zhuǎn)染完成后5 h，向各孔加入脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)(Sigma)，終濃度為 1 μg/μl。加入 LPS后2 h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液及細(xì)胞，用于ELISA及real-time PCR檢測。重復(fù)實驗3次。

表1 siRNA序列Tab.1 Sequences of siRNAs

1.3 Real-time PCR 按照TaKaRa公司RNA提取試劑盒說明書提取各組細(xì)胞總 RNA，取1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，進行real-time PCR檢測。應(yīng)用Primer express2.0軟件設(shè)計小鼠 TNF-α、IL-1β、IL-6、β-actin引物和Taqman探針，序列如表2所示。引物由上海生工合成，探針由TaKaRa公司合成。逆轉(zhuǎn)錄、real-time PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件均參照PrimeScript RT-PCR試劑盒說明(TaKaRa)。Realtime PCR反應(yīng)于Roter Gene RG3500 PCR儀進行。Roter Gene6軟件自動記錄 Ct值。以2-ΔΔCt法計算TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA 相 對 表 達 量，ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)待測組 -(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)空白對照組。計算出各組mRNA表達的抑制率，mRNA抑制率=［(1-mRNA相對表達量處理組/mRNA相對表達量陰性對照組)/1］×100%。

1.4 ELISA 取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA法檢測TNF-α含量，按說明書操作(武漢博士德)。并計算出各組 TNF-α的蛋白抑制率，蛋白抑制率=［(TNF-α 陰 性對 照組 -TNF-α 處 理組)/TNF-α 陰性 對照組］×100%。

1.5 慢病毒制備

1.5.1 shRNA設(shè)計 篩選出高效siRNA序列，按慢病毒載體構(gòu)建要求設(shè)計、合成寡核苷酸片段。正向單鏈內(nèi)21nt的寡核苷酸以正反向組合，中間添加loop結(jié)構(gòu)，使寡核苷酸形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，寡核苷酸兩端帶有酶切位點。雙鏈結(jié)構(gòu)具體序列為:5'-CCGGAAGAGGCTGAGACATAGGCACTTCAAGAGAGTGCCTATGTCTCAGCCTCTTTTTTTG-3'，5'-AATTCAAAAAAAGAGGCTGAGACATAGGCACTCTCTTGAAGTGCCTATGTCTCAGCCTCTT-3'。

1.5.2 重組慢病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建 寡核苷酸片段退火形成雙鏈DNA，反應(yīng)條件為90℃ 4 min，70℃ 10 min，緩慢降至室溫。pGCSIL-GFP載體(上海吉凱公司)經(jīng)AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切，37℃1 h，凝膠電泳回收線性化pGCSIL-GFP片段。運用T4連接酶連接經(jīng)退火形成的雙鏈DNA和線性化pGCSIL-GFP片段，4℃16 h。取連接產(chǎn)物pGCSIL-GFP-shRNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，將已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基，37℃16 h。挑選單菌落進行PCR反應(yīng)。PCR上游引物:5'-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3'，下游引物:5'-GTAATACGGTTATCCACGCG-3'。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性30 s;94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30 個循環(huán);72℃延伸6 min。PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳。挑選單菌落搖菌提取質(zhì)粒送測序鑒定。

1.5.3 慢病毒包裝 293T細(xì)胞以含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d取對數(shù)生長期細(xì)胞以6×108個/L的密度接種于15 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，待細(xì)胞密度達70%～80%時用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2 h將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。取慢病毒穿梭質(zhì)粒、慢病毒包裝質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000(Invitrogen)混合制成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染8 h后將培養(yǎng)基更換為含10%血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集上清液，5 200 r/min離心10 min，以0.45 μm 濾器過濾，濃縮后置于-80℃凍存，將其命名為lentivirus-shTNF。

1.5.4 慢病毒滴度測定 293T細(xì)胞以4×104個/孔的密度接種于96孔板，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后行病毒感染。吸出培養(yǎng)基90 μl棄去，加入90 μl經(jīng)倍比稀釋的病毒液，培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基。96 h后于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達。記下熒光細(xì)胞數(shù)在5左右的孔及其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)(熒光細(xì)胞計數(shù)由2人獨立完成)。滴度計算公式:病毒滴度(TU/μl)=熒光細(xì)胞數(shù)/對應(yīng)稀釋倍數(shù)。

1.5.5 慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo) RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)如上文1.2部分所述?；蜣D(zhuǎn)導(dǎo)前1 d取對數(shù)生長期細(xì)胞以4×104個/孔的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。實驗分為3組:空白對照組、慢病毒陰性對照組和慢病毒RNAi組。每組設(shè)復(fù)孔3只。細(xì)胞接種24 h后各孔加入對應(yīng)病毒1×106TU，MOI(Multiplicity of infection)為25，空白對照組加入等體積培養(yǎng)液。慢病毒感染24 h后各組均更換培養(yǎng)液。換液48 h后向各組加入脂多糖，終濃度為1 μg/μl。加入LPS 2 h后收集上清液及細(xì)胞儲存，用于real-time PCR檢測。重復(fù)實驗3次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 運用SigmaStat 11.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。定量資料以Mean±SEM表示，各組間比較采用one-way ANOVA test，實驗組與對照組相比采用Dunnett t檢驗。以P＜0.05為顯著性差別界限值。

2 結(jié)果

2.1 siRNA轉(zhuǎn)染 RAW264.7細(xì)胞后 TNF-α、IL-1β及IL-6 mRNA 表達 siRNA1、siRNA2、siRNA3、陰性對照組TNF-α mRNA相對表達量為(0.24±0.01)、(0.16±0.02)、(0.19±0.01)、(0.95±0.02)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，各組間表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=531.3，P＜0.000 1)。與陰性對照相比，mRNA 抑制率分別為74.26%、83.09%、79.93%。siRNA1、siRNA2、siRNA3及陰性對照組的IL-1β mRNA相對表達量分別為(0.93±0.04)、(0.93±0.02)、(0.92±0.02)、(0.93±0.03)，組間差別無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.981，P=0.980 7 ＞0.05)。siRNA1、siRNA2、siRNA3及陰性對照組的IL-6 mRNA相對表達量分別為(0.96±0.04)、(1.00 ±0.07)、(0.92 ±0.03)、(0.94±0.01)，組間差別無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.739，P=0.586 7＞0.05)。見圖1。

表2 PCR引物及探針序列Tab.2 Sequences of primers and probes

圖1 不同組別RAW264.7細(xì)胞TNF-α mRNA表達水平Fig.1 TNF-α mRNA relative expression levels of different RAW264.7 groups

2.2 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNF-α蛋白表達

siRNA1、siRNA2、siRNA3、陰性對照組 TNF-α 蛋白表達量分別為(23.95±1.21)、(17.27±1.46)、(19.07 ± 1.57)、(35.37 ±2.93)ng/ml，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=18.1，P=0.000 6＜0.001)。與陰性對照相比，TNF-α蛋白表達抑制率分別為32.29%、51.16%、46.08%。陰性對照組、空白對照組(34.75±1.67)ng/ml及試劑對照組(30.48±1.701)ng/ml相比，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.49，P=0.30＞0.05)。見圖2。

圖2 不同組別RAW264.7細(xì)胞TNF-α蛋白表達水平Fig.2 TNF-α protein expression levels of different RAW264.7 groups

2.3 重組慢病毒穿梭質(zhì)粒PCR產(chǎn)物電泳鑒定 重組慢病毒質(zhì)粒PCR擴增產(chǎn)物為343 bp，空載體PCR產(chǎn)物為306 bp，插入片段為61 bp。鑒定結(jié)果與預(yù)期一致(注:pGCSIL-GFP載體中Age I、EcoR I位點間尚有4個酶切位點，總長度為24 bp。即306 bp-24 bp+插入片段=343 bp)。見圖3。

圖3 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.3 PCR product electrophoresis map

2.4 重組慢病毒穿梭質(zhì)粒DNA測序 DNA測序顯示pGCSIL-GFP-shRNA測序反應(yīng)中斷，但已顯示部分插入序列。見圖4。

2.5 慢病毒包裝及鑒定 慢病毒穿梭質(zhì)粒、慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后熒光顯微鏡下可見細(xì)胞生長良好，熒光表達強。96 h后熒光顯微鏡下觀察，熒光細(xì)胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)增加而減少。經(jīng)計算慢病毒滴度≥2×106TU/μl。見圖5。

2.6 慢病毒介導(dǎo)的RNAi對RAW264.7細(xì)胞TNF-α表達的影響 RAW264.7細(xì)胞經(jīng)慢病毒感染70 h后于熒光顯微鏡下觀察感染效率。結(jié)果如圖6所示，MOI=25時，慢病毒顆粒感染70 h后，感染效率約為60%。RAW264.7細(xì)胞經(jīng)慢病毒感染72 h后加入LPS刺激2 h，采用 real-time PCR檢測各組TNF-α mRNA表達。結(jié)果顯示，與慢病毒陰性對照組(0.93±0.013)相比，慢病毒 RNAi組(0.29 ±0.021)TNF-α mRNA 表達水平降低，t=25.4，P ＜0.000 1，抑制率mRNA水平=70.9%。此結(jié)果說明靶向TNF-α的慢病毒顆粒達到抑制TNF-α表達的效果。

圖4 重組質(zhì)粒DNA測序圖(部分)Fig.4 DNA sequencing map of recombinant plasmid

圖5 熒光顯微鏡下慢病毒感染293T細(xì)胞后綠色熒光蛋白表達Fig.5 GFP expression of 293T cells transfected by lentivirus particles

圖6 熒光顯微鏡下觀察慢病毒感染RAW264.7細(xì)胞后綠色熒光蛋白表達Fig.6 GFP expression of RAW264.7 cells transfected by lentivirus particles

3 討論

TNF-α是導(dǎo)致炎癥性關(guān)節(jié)疾病的核心細(xì)胞因子［9］，因而本文擬構(gòu)建靶向小鼠 TNF-α基因的RNAi慢病毒載體，為RNAi基因治療提供基礎(chǔ)。構(gòu)建高效干擾片段和有效基因?qū)敕椒ㄊ荝NAi基因治療的關(guān)鍵。

本文設(shè)計、合成了三對針對TNF-α的siRNA，并在細(xì)胞水平進行了篩選。小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞是常用的炎癥細(xì)胞模型，經(jīng)LPS刺激后可高表達 TNF-α 等細(xì)胞因子［16，17］，因而可用于siRNA的篩查。siRNA轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞后，并給以LPS刺激，分別在mRNA水平和蛋白水平檢測RNAi的基因沉默效應(yīng)。結(jié)果顯示3組 siRNAs對TNF-α的表達抑制在mRNA、蛋白水平與對照組相比均有統(tǒng)計學(xué)差異，其中siRNA2在mRNA和蛋白水平均有最高的抑制效應(yīng)，可作為沉默效率最高的干擾序列用于后續(xù)研究。

TNF-α表達受抑制，IL-1β、IL-6等炎癥因子產(chǎn)生理應(yīng)下降。因為TNF-α可進一步誘導(dǎo)IL-1β、IL-6的產(chǎn)生。但結(jié)果顯示，靶向TNF-α基因的RNAi未對IL-1β、IL-6 mRNA表達產(chǎn)生影響。這可能是由于雖然靶向TNF-α的siRNA抑制了TNF-α的表達，但LPS對該炎癥細(xì)胞模型的刺激作用仍然存在，LPS與RAW264.7細(xì)胞表面受體結(jié)合，通過激活NF-κB誘導(dǎo) IL-1β、IL-6的產(chǎn)生。這也說明 RNAi的特異性。

本文先行siRNA轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，再LPS刺激，因而轉(zhuǎn)染7 h后即觀察到基因沉默效應(yīng)。在另一小鼠單核巨噬細(xì)胞株J774.1也有類似的報道［15］。但既往報道，siRNA的基因沉默效應(yīng)，mRNA水平多于轉(zhuǎn)染24～48 h后觀察到，蛋白水平則多于轉(zhuǎn)染48～72 h后觀察到。

脂質(zhì)體和電轉(zhuǎn)染是基因轉(zhuǎn)染的常用方法，但轉(zhuǎn)染后目的基因片段易降解，且電轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生存率低及臨床實驗可用性低［18，19］。近年來病毒載體如腺病毒、腺相關(guān)病毒及慢病毒載體應(yīng)用于分子生物學(xué)研究中，但腺病毒難于轉(zhuǎn)染單核細(xì)胞［20］。近年研究發(fā)現(xiàn)慢病毒載體可感染包括單核細(xì)胞在內(nèi)的多種難于轉(zhuǎn)染細(xì)胞［6-8，21］。另外，慢病毒載體可實現(xiàn)靶向目的基因的干擾片段整合入基因組，從而長期抑制目的基因表達，這是其用于體外以及體內(nèi)實驗研究的優(yōu)勢，因此本文選用慢病毒載體作為RNAi載體。

本文以pGCSIL-GFP載體為干擾質(zhì)粒，含U6啟動子，可在宿主細(xì)胞中持續(xù)表達shRNA，同時表達GFP。在重組慢病毒穿梭質(zhì)粒PCR產(chǎn)物鑒定中，電泳顯示陽性克隆中有61 bp的目的片段插入。DNA測序只顯示了部分插入序列，這可能是shRNA易形成二級結(jié)構(gòu)所致［22，23］。PCR 產(chǎn)物電泳鑒定結(jié)合DNA測序確定重組成功。在慢病毒包裝系統(tǒng)中除pGCSIL-GFP載體外還有包裝載體，包裝載體含有慢病毒包裝所必需的其他元件及衣殼蛋白。293T細(xì)胞作為病毒包裝細(xì)胞可產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，可用于檢測病毒包裝效果及感染目的細(xì)胞的感染效率。濃縮后的慢病毒滴度為2×106TU/μl，可用于后續(xù)的體外及體內(nèi)實驗研究。

本文構(gòu)建了靶向TNF-α基因的RNAi慢病毒載體，經(jīng)鑒定載體構(gòu)建成功，經(jīng)包裝、濃縮后獲得了較高滴度的慢病毒載體，為后續(xù)靶向TNF-α的RNAi基因治療實驗性研究提供了基礎(chǔ)。

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