吳鳳麟 張文峰 何 免 楊 暖 沈 晗 薄華本 邵紅偉 黃樹林

(廣東藥學院生命科學與生物制藥學院，廣州 510006)

腫瘤細胞可以通過誘導免疫耐受、抗原調(diào)變、分泌免疫抑制因子等不同機制逃脫機體免疫監(jiān)視。研究者發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞表達的大多數(shù)抗原并非具備特異性的新抗原，而是極其接近機體正常細胞表達的組織分化抗原［1，2］。由于胸腺的陰性選擇清除了表達可識別自身抗原肽/MHC復合物的T細胞受體(T cell receptor，TCR)的T細胞，使成熟T細胞難以識別腫瘤抗原肽進而活化發(fā)揮免疫效應(yīng)。為解決此問題，研究者通過從患者腫瘤浸潤細胞(Tumor-infiltrating lymphocyte，TIL)中篩選獲得反應(yīng)性T細胞克隆，繼而鑒定了可特異性識別腫瘤抗原的TCR分子，再將編碼腫瘤特異性TCR的基因?qū)氤墒霻細胞，最終獲得了TCR基因修飾T細胞(TCR gene engineered T cell)。腫瘤特異性TCR基因修飾T細胞可在體外特異性識別抗原陽性腫瘤細胞，并在回輸患者體內(nèi)后重建抗腫瘤免疫。通過將MART-1抗原特異的TCR基因轉(zhuǎn)入黑色素瘤病人的外周血淋巴細胞(Peripheral blood lymphocyte，PBL)后回輸，成功地在患者體內(nèi)建立了針對抗原陽性腫瘤的免疫能力，部分患者可見腫瘤完全轉(zhuǎn)歸［3］。用 NY-ESO-1抗原特異性TCR基因修飾T細胞在以黑色素瘤和滑膜肉瘤患者為對象的臨床試驗中也獲得了類似結(jié)果［4］。以上研究結(jié)果提示，TCR基因轉(zhuǎn)染T細胞作為一種有效的免疫療法已經(jīng)具備了臨床應(yīng)用前景［5］。

本實驗室一直從事腫瘤特異性TCR基因的篩選與功能研究。在前期研究中，課題組利用基因優(yōu)勢取用技術(shù)篩選獲得了可特異性識別肝癌抗原的TCRVα12.2-Vβ7.1 基因［6，7］。在本研究中，我們通過重組腺病毒載體攜帶的TCRVα12.2-Vβ7.1基因轉(zhuǎn)染T細胞，并作用于不同腫瘤細胞株。證實了特異性TCR基因有效轉(zhuǎn)染T細胞后，可賦予T細胞識別腫瘤抗原的能力，進而充分活化發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 人源性肝癌細胞株HepG-2(HLA-A2+， AFP+)， SMMC-7721(HLA-A2+，AFP+);人源性乳腺癌細胞株 MCF-7(HLA-A2+，AFP－);人胚腎細胞系HEK-293均為本實驗室保存。重組腺病毒 Ad5F35由本室構(gòu)建保存［8］。TCRVα12.2、Vβ7.1特異性引物及病毒纖毛基因引物合成于Invitrogen公司。1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司，人淋巴細胞分離液購自TBD公司，重組人IFN-γ購自Boehringer Ingelheim公司，重組人IL-2、鼠抗人CD3單克隆抗體、鼠抗人CD28單克隆抗體購自R＆D公司，鈣黃綠素(Calcein-AM)購自日本同仁化學，PE標記抗人 TCR Vβ7抗體、PC5標記抗人CD3抗體、PC5標記抗人CD8抗體、PE標記抗人FasL抗體均購自BioLegend公司，F(xiàn)ITC標記抗人TCRα12抗體購自Endogen公司，Annexin V-PI細胞凋亡檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物公司。全波長多功能酶標儀為美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品，流式細胞儀(EPICS-XL)為美國Beckman-Coulter公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 人PBMC分離 取HLA-A2陽性健康人外周血，F(xiàn)icoll-Hapaque密度梯度離心法分離PBMC。

1.2.2 T細胞培養(yǎng)與刺激活化 分離獲得的PBMC在添加10%胎牛血清、雙抗(青霉素100 U/ml，鏈霉素100 μg/ml)的RPMI1640完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)。分離后第1天。以抗人CD3單克隆抗體(OKT3，30 ng/ml)，抗人CD28單克隆抗體(1 ng/ml)及重組人IL-2(300 U/ml)完成刺激。此后每3天半量換液。并補加重組人IL-2(終濃度為50 U/ml)。

1.2.3 重組腺病毒Ad5F35-TRAV-TRBV的構(gòu)建與鑒定 將TCA-12-2基因通過EcoRⅠ、SalⅠ位點連入載體 pIRES2-AcGFP1，獲得中間載體 pIRESAcGFP1-TCA;TCB-7.1基因通過BstXⅠ和NotⅠ酶切后，克隆于pIRES-TCA，得到 pIRES-TCA-TCB載體，隨后通過亞克隆連入載體pDC315，得到重組質(zhì)粒 pDC315-TCA-12-2-TCB-7.1。將重 組 載體pDC315-TCA-12-2-TCB-7.1與Ad5f35骨架載體通過陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293細胞。載體轉(zhuǎn)染后12天通過顯微鏡觀察病斑出現(xiàn)。通過TCID50法測病毒滴度。提取重組腺病毒基因組DNA后，TCRVα12.2與Vβ7.1特異性引物PCR擴增后，產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳分離后溴化乙錠顯色觀察目的基因條帶。PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切、克隆轉(zhuǎn)化后送Invitrogen公司測序鑒定。

1.2.4 重組腺病毒Ad5F35-TRAV-TRBV轉(zhuǎn)染T細胞 PBMC分離后第3天完成腺病毒轉(zhuǎn)染。將PBMC調(diào)整濃度為1×106個/ml，并用含2% 血清的1640培養(yǎng)基接種于細胞培養(yǎng)瓶中。按不同感染復數(shù)(Multiplicity of infection，MOI)比例加入重組病毒顆粒。37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育12 h后換液，繼續(xù)用含10%血清及IL-2的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)?？谷薚CRα12、TCRβ7熒光抗體染色后，流式細胞術(shù)檢測目的基因表達比例。轉(zhuǎn)染后3 d完成抗腫瘤功能實驗。

1.2.5 鈣黃綠素染色法檢測T細胞腫瘤殺傷活性

將各組腫瘤細胞(HepG-2，SMMC-7721，MCF-7)濃度調(diào)節(jié)為1×106個/ml，重懸于含10%FCS的完全培養(yǎng)基中。加入終濃度為15 μmol/L的 Calcein-AM，37℃孵育30 min。含10%血清的完全培養(yǎng)基洗滌兩次。完全培養(yǎng)基調(diào)節(jié)靶細胞至終濃度1×105個/ml。倒置熒光顯微鏡觀察染色效果。將靶細胞接種于V底96孔培養(yǎng)板，100 μl/孔。按不同效靶比(3∶1、10∶1、30∶1)加入以下各組效應(yīng)細胞:a.PBMC對照組;b.空載體轉(zhuǎn)染組;c.TCR基因轉(zhuǎn)染組。并設(shè)自發(fā)釋放組(只加入完全培養(yǎng)基)、最大釋放組(加入2%TritonX-100)?？傮w積均為100 μl/孔。以上各實驗組和對照組均為5個復孔。37℃孵育4 h，離心機離心96孔板，1 000 r/min離心5 min。從各孔中吸取75 μl上清。轉(zhuǎn)移至預先標記好的新的96孔培養(yǎng)板。熒光酶標儀讀取各孔熒光值，激發(fā)光波長485 nm，發(fā)射光波長535 nm。根據(jù)以下公式計算各組效應(yīng)細胞的CTL活性:特異性裂解百分比=(實驗組熒光值－自發(fā)釋放組熒光值)/(最大釋放組熒光值－自發(fā)釋放組熒光值)×100%。

1.2.6 AnnexinV雙染法檢測腫瘤細胞凋亡率 將腫瘤細胞HepG-2濃度調(diào)節(jié)至2×105個/ml，接種于六孔板(1 ml/孔)。分別加入各組效應(yīng)細胞:a.PBMC對照組;b.空載體轉(zhuǎn)染組;c.TCR基因轉(zhuǎn)染組，效靶比30∶1，共培養(yǎng)4 h。按說明書完成樣本制備后上機。以FITC單染為早期凋亡細胞，PIFITC雙染為晚期凋亡/死亡細胞，PI單染為死亡細胞，雙陰性細胞為正常細胞。統(tǒng)計各類細胞比例。

1.2.7 流式細胞術(shù)檢測T細胞膜表面FasL表達各組效應(yīng)細胞作用以效靶比30∶1與靶細胞HepG-2共培養(yǎng)4 h后，吸取細胞懸液，加入熒光標記抗人CD8與抗人FasL抗體，完成樣本制備后流式檢測。

1.2.8 ELISA法檢測細胞因子分泌 將腫瘤細胞HepG-2濃度調(diào)節(jié)至2×105個/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，100 μl/孔。分別加入各組效應(yīng)細胞。效靶比為30∶1，共培養(yǎng)24 h。到達預定培養(yǎng)時間后，收集各組細胞培養(yǎng)上清液，雙抗體夾心 ELISA法檢測IFN-γ與IL-2含量，操作按ELILSA試劑盒說明書進行。根據(jù)酶標儀測量的樣本吸光度A450值和標準曲線計算 IFN-γ和IL-2濃度。

1.3 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差來表示。應(yīng)用SPSSv16.0軟件(SPSS Inc.Chicago，USA)進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析比較各組差異。當P＜0.05時，被認為差異具有統(tǒng)計學意義。GraphPad Prism 5.0軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 重組腺病毒Ad5F35-TRAV-TRBV的構(gòu)建與鑒定 前期實驗發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體等非病毒載體介導外源性TCR基因轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染效率較低。同時，TCR Vα基因和TCR Vβ基因單獨轉(zhuǎn)染還存在著與內(nèi)源性TCR基因錯配的可能。本實驗室在Ad5型腺病毒的基礎(chǔ)上，通過細菌內(nèi)同源重組的方法，構(gòu)建了嵌合型腺病毒載體Ad5F35-TRAV-TRBV。對5型腺病毒纖毛基因頭節(jié)部分進行替換，形成具有35型腺病毒纖毛桿(shaft)和頭節(jié)(knob)的嵌合型腺病毒載體Ad5/F35(圖1)。獲得重組質(zhì)粒pDC315-TCA-12-2-TCB-7.1后，將重組載體pDC315-TCA-12-2-TCB-7.1與Ad5f35骨架載體通過陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293細胞。載體轉(zhuǎn)染后12天可在鏡下觀察到病斑形成。提取重組腺病毒Ad5F35-TRAV-TRBV的基因組DNA，以TCRVα12.2與Vβ7.1特異性引物PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，觀察到了目的產(chǎn)物帶(圖 2，TCR Vα12.2:816 bp，Vβ7.1:942 bp)。產(chǎn)物經(jīng)測序后比對，與Genbank序列一致。

圖1 Ad5和Ad5/F35纖毛基因結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Knob gene structure of Ad5 and Ad5/F35 vector

圖2 重組腺病毒Ad5F35-TRAV-TRBV PCR擴增與鑒定Fig.2 PCR amplification and identification of recombinant adenovirus Ad5F35-TRAV-TRBV

2.2 重組腺病毒Ad5F35-TRAV-TRBV轉(zhuǎn)染T細胞后目的基因表達效率 通過HEK293細胞包裝獲得重組TCR腺病毒顆粒后，首先檢測了不同MOI條件下腺病毒載體的轉(zhuǎn)染效率。重組TCR腺病毒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)第3天的 PBMC(按照MOI=50，100，200分成3個轉(zhuǎn)染組，完成5個獨立樣本實驗)。轉(zhuǎn)染后24h流式檢測TCRVβ7.1陽性細胞比例，以CD3陽性細胞框選設(shè)門。結(jié)果表明，對照組TCRVβ7陽性細胞比例較低(圖3A，5.2%)。重組腺病毒轉(zhuǎn)染后，TCRVβ7陽性細胞比例明顯上升。在MOI=100時，轉(zhuǎn)染后淋巴細胞TCRVβ7陽性細胞比例最高(圖 3C，17.8%)。MOI=200時，TCRVβ7陽性細胞比例反而有所降低(圖 3D，13.5%)。同時細胞數(shù)量有所減少。對不同MOI值轉(zhuǎn)染24 h后TCRVβ7陽性細胞比例結(jié)果進行統(tǒng)計學分析(表1)。各實驗組與對照組陽性細胞比例差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。MOI=100組陽性細胞比例最高，與MOI=50組和MOI=200組陽性細胞比例差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。以MOI=100轉(zhuǎn)染PBMC 72 h后，TCRα12，TCRVβ7熒光抗體標記后，流式檢測了外源TCR基因在T細胞表面的表達情況(圖4)。結(jié)果顯示TCRVα12-Vβ7雙陽性細胞比例在25%～30%(圖4C)之間，高于未轉(zhuǎn)染對照組(TCRVα12-2 Vβ7.1雙陽性細胞比例低于1%，圖4A)及空載體轉(zhuǎn)染組(雙陽性細胞比例低于1%，圖4B)，證實外源TCR基因可有效表達于 T細胞。

圖3 流式細胞術(shù)檢測重組TCR腺病毒以不同MOI值轉(zhuǎn)染后TCR Vβ7陽性細胞比例Fig.3 Frequency of TCR Vβ7+T cells was detected by FACS 24 h after transduced with recombinant TCR adeno virus at different MOI(24 h)

表1 不同MOI值轉(zhuǎn)染24 h后TCRVβ7陽性細胞比例(，n=5)Tab.1 Frequency of TCR Vβ7+T cells transduced on different MOI 24 h after transduction(，n=5)

表1 不同MOI值轉(zhuǎn)染24 h后TCRVβ7陽性細胞比例(，n=5)Tab.1 Frequency of TCR Vβ7+T cells transduced on different MOI 24 h after transduction(，n=5)

% 239.644 ＜0.001 MOI=50(8.300±0.696)%MOI=100(17.120±0.983)%MOI=200(12.760%±0.598)%F P Control(5.140±0.688)Groups The frequency of TCR Vβ7+T cells

圖4 流式檢測重組TCR腺病毒轉(zhuǎn)染后TCRVα12-Vβ7雙陽性細胞比例(轉(zhuǎn)染后3 d)Fig.4 Frequency of TCRVα12+Vβ7+cells was analyzed by FACS 3 days after transduction

圖5 各組效應(yīng)細胞以不同效靶比作用于靶細胞后特異性裂解百分比Fig.5 Specific lysis of target tumor cells coculture with different effector T cells at different effector-totarget ratio(E/T ratio)

2.3 特異性TCR轉(zhuǎn)染T細胞的腫瘤殺傷活性 分別將PBMC對照組，空載體轉(zhuǎn)染組，TCR基因轉(zhuǎn)染組以不同效靶比作用于不同腫瘤細胞株。4 h后檢測各組效應(yīng)細胞腫瘤殺傷活性。如圖5A所示，空載體轉(zhuǎn)染組和PBMC組在各效靶比對肝癌細胞株HepG-2的腫瘤殺傷活性的差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。特異性TCR基因轉(zhuǎn)染后，T細胞的腫瘤殺傷活性上升，在各效靶比與PBMC對照組及空載體轉(zhuǎn)染組差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.00 1)。在各組細胞作用于肝癌細胞株SMMC-7721后也獲得了類似的結(jié)果(圖5B)。特異性TCR基因轉(zhuǎn)染T細胞的腫瘤殺傷活性在各效靶比與PBMC對照組及空載體轉(zhuǎn)染組差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.00 1)。而空載體轉(zhuǎn)染組和PBMC組在各效靶比的腫瘤殺傷活性的差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與作用于肝癌細胞系不同的是，各組效應(yīng)細胞作用于AFP表達陰性的乳腺癌細胞MCF-7之后(圖5C)，在各效靶比的腫瘤殺傷活性的差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。實驗同時檢測了重組TCR腺病毒載體以不同MOI值感染T細胞引起特異性TCR陽性細胞比例的差異對T細胞殺傷靶細胞的影響。結(jié)果顯示，特異性TCR陽性細胞比例上升可有效促進T細胞殺傷靶細胞HepG-2(圖6)。高TCR陽性細胞比例組(MOI=100)在各效靶比都有最高的靶細胞特異性裂解百分比，與中TCR基因陽性細胞比例組(MOI=200)，低TCR基因陽性細胞比例組(MOI=50)及PBMC對照組(MOI=50)相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。

圖6 不同MOI值轉(zhuǎn)染T細胞作用于靶細胞HepG-2后特異性裂解百分比(，n=5)Fig.6 Specific lysis of target tumor cells coculture with T cells transduced on different MOI(，n=5)

表2 各組效應(yīng)細胞誘導HepG-2細胞凋亡比例(，n=4)Tab.2 Frequency of apoptotic cells in HepG-2 after coculture 4 h with different effector T cells(，n=4)

表2 各組效應(yīng)細胞誘導HepG-2細胞凋亡比例(，n=4)Tab.2 Frequency of apoptotic cells in HepG-2 after coculture 4 h with different effector T cells(，n=4)

Note:Compared with PBMC control group，1)P ＜0.001;compared with empty vector group，2)P ＜0.001.

% 130.182 ＜0.001 Transduced with empty vector(5.525±0.608)%TCR gene transferred(19.158±2.316)%1)2)F P PBMC control group(5.150±0.369)Groups The frequency of apoptotic cells

2.4 靶細胞HepG-2的凋亡比例 以Annexin V-PI雙染法進一步檢測了不同組效應(yīng)細胞(PBMC對照組，空載體轉(zhuǎn)染組，TCR基因轉(zhuǎn)染組)以效靶比30∶1與HepG-2共培養(yǎng)4 h后，靶細胞凋亡比例。以PI單染為死亡細胞，Annexin V單染為早期凋亡細胞，Annexin V-PI雙染為晚期凋亡/死亡細胞。如圖7結(jié)果所示。與PBMC對照組(圖7A，凋亡細胞比例＜6%)及空載體轉(zhuǎn)染組(圖7B，凋亡細胞比例＜7%)相比，TCR基因轉(zhuǎn)染T細胞作用后靶細胞凋亡比例(圖7C，凋亡細胞比例＞20%)上升。

圖7 不同組效應(yīng)細胞作用靶細胞HepG-2 4 h后，靶細胞凋亡比例Fig.7 Frequency of apoptotic cells in HepG-2 4 h after coculture with different T cells

圖8 作于靶細胞HepG-2 4 h后，各組效應(yīng)細胞CD8+T細胞中FasL陽性比例Fig.8 Frequency of FasL+cell in CD8+T cell of different effector cells 4 h after cocluture with target cell HepG-2

對各組效應(yīng)細胞誘導HepG-2細胞凋亡比例進行統(tǒng)計學分析(表2)。對照組和空載體組靶細胞凋亡比例差異無統(tǒng)計學意義。TCR基因轉(zhuǎn)染組靶細胞凋亡比例最高，與對照組和空載體組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.00 1)。

2.5 各組T細胞作用于靶細胞HepG-2后膜表面FasL表達情況 不同組效應(yīng)細胞(PBMC對照組，空載體轉(zhuǎn)染組，TCR基因轉(zhuǎn)染組)以效靶比30∶1與靶細胞HepG-2共培養(yǎng)4 h后，CD8+細胞框選設(shè)門，經(jīng)抗人FasL熒光抗體染色，檢測了各組效應(yīng)細胞CD8+T細胞膜表面FasL表達情況。如圖8結(jié)果所示。作用于靶細胞后，與PBMC對照組(圖8A，1.2%)及空載體轉(zhuǎn)染組(圖8B，4.1%)相比，TCR基因轉(zhuǎn)染組CD8+細胞中Fas陽性比例上升(圖8C，31.5%)。對各組效應(yīng)細胞CD8+T細胞中FasL陽性比例進行統(tǒng)計學分析(表3)。對照組和空載體組FasL陽性細胞比例差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。TCR基因轉(zhuǎn)染組FasL陽性細胞比例最高，與對照組和空載體組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.00 1)。

2.6 各組T細胞作用于靶細胞后細胞因子分泌不同組效應(yīng)細胞(PBMC對照組，空載體轉(zhuǎn)染組，TCR基因轉(zhuǎn)染組)以效靶比30∶1作用靶細胞HepG-2，SMMC-7721 24 h后，ELISA法檢測了各組效應(yīng)細胞IFN-γ與IL-2的分泌情況。圖9A結(jié)果顯示，TCR基因轉(zhuǎn)染組作用于靶細胞HepG-2后，上清液中IFN-γ含量(27.81±1.85)ng/ml明顯高于PBMC對照組(4.20±0.63)ng/ml和空載體轉(zhuǎn)染組(4.46±0.44)ng/ml(P＜0.00 1)。各組細胞作用于SMMC-7721后也獲得了類似的結(jié)果。與PBMC對照組(4.10±0.42)ng/ml和空載體轉(zhuǎn)染組(4.08±0.29)ng/ml相比，TCR基因轉(zhuǎn)染組IFN-γ分泌能力(25.12±2.04)ng/ml明顯上升(P＜0.00 1)。如圖9B所示。TCR基因轉(zhuǎn)染組作用于靶細胞HepG-2后，上清液中IL-2含量(1 755.80±57.33)pg/ml與對照組(1 726.20±61.97)pg/ml及空載體轉(zhuǎn)染組(1 706.80±34.43)pg/ml相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。各組細胞作用于SMMC-7721后，TCR基因轉(zhuǎn)染組IL-2分泌(1 631.40±47.25)pg/ml與對照組(1 575.60±53.41)pg/ml相比，差異同樣無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。但高于空載體轉(zhuǎn)染組(1 545.80±40.96)pg/ml(P＜0.05)。以上結(jié)果提示，TCR基因轉(zhuǎn)染能夠有效促進T細胞作用于抗原陽性靶細胞后分泌IFN-γ，而對T細胞IL-2分泌無明顯影響。

表3 作用于靶細胞HepG-2 4 h后各組效應(yīng)細胞CD8+T細胞中FasL陽性比例(n=4，)Tab.3 Frequency of FasL+cell in CD8+T cell of different effector cells 4 h after cocluture with target cell HepG-2(n=4，)

表3 作用于靶細胞HepG-2 4 h后各組效應(yīng)細胞CD8+T細胞中FasL陽性比例(n=4，)Tab.3 Frequency of FasL+cell in CD8+T cell of different effector cells 4 h after cocluture with target cell HepG-2(n=4，)

Note:Compared with PBMC control group，1)P ＜0.001;compared with empty vector group，2)P ＜0.001.

Groups FasL+cell F P PBMC control 1.675±0.457% 323.596 ＜0.001 Transduced withempty vector 3.425±0.640%TCR gene transferred 27.600±2.677%1)2)

圖9 各組效應(yīng)細胞作用于不同靶細胞24 h后上清中IFN-γ(A)及 IL-2(B)含量Fig.9 IFN-γ(A)and IL-2(B)contents in supernatant of each group of effector T cells 24 h after coculture with different target cells

3 討論

自上世紀80年代FDA批準首例TCR基因轉(zhuǎn)染的人體實驗以來［9］，TCR基因修飾T細胞治療已經(jīng)在腫瘤抗原特異性TCR篩選、TCR基因轉(zhuǎn)染技術(shù)和增強T細胞效應(yīng)功能等方面取得了重要進展。隨著腫瘤特異性抗原和腫瘤相關(guān)抗原的不斷發(fā)現(xiàn)和鑒定，TCR基因修飾T細胞治療將有望擴展運用于各種不同類型的實體瘤的臨床治療［3］。通過TCR基因轉(zhuǎn)染技術(shù)獲得腫瘤特異性T細胞的關(guān)鍵策略包括:①篩選獲得可特異識別腫瘤抗原的TCR基因;②選擇高效的基因轉(zhuǎn)染方法。在本研究中，我們以之前篩選的肝癌抗原特異性TCR基因為腫瘤抗原識別基因，以改造的嵌合型腺病毒載體Ad5F35-TRAV-TRBV為基因轉(zhuǎn)染工具，對T細胞進行了基因修飾，使其獲得了良好的腫瘤抗原識別特異性。

在確定了腫瘤特異性TCR基因后，采用合適載體并設(shè)計有效的表達盒對外源TCR基因表達效率具有關(guān)鍵作用［5］。在目前TCR基因修飾T細胞治療的臨床實驗中，主要使用病毒類載體作為TCR基因傳輸系統(tǒng)。包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒及慢病毒等。考慮到逆轉(zhuǎn)錄病毒應(yīng)用于人體可能存在的染色體整合風險［10］。我們選擇了腺病毒載體作為本研究的TCR基因傳輸系統(tǒng)。

Ad5型腺病毒是基因治療的常用載體之一，然而由于攝入Ad5型腺病毒必需的柯薩奇/腺病毒受體(Coxsackie/adenovirus receptors，CAR)及 αV 型整合素在T細胞表面表達水平較低［11］，使Ad5型病毒對T細胞的轉(zhuǎn)染效率低下［12］。因此本實驗室對傳統(tǒng)的Ad5型腺病毒進行了改造。即將Ad35型腺病毒的knob重連至Ad5型腺病毒shaft下游，從而獲得了嵌合型Ad5/35型fiber，以利用Ad35型腺病毒的knob靶向結(jié)合幾乎表達所有人類細胞表面的CD46分子的特性［13］。成功構(gòu)建嵌合腺病毒載體后，以IRES連結(jié)TCR Vα12.2、Vβ7.1基因片段，并將其重組連結(jié)入嵌合腺病毒載體。以HEK293細胞包裝完整病毒顆粒后感染T細胞。結(jié)果顯示，重組腺病毒可有效轉(zhuǎn)染T細胞。為獲得最佳感染條件。我們設(shè)置了MOI梯度實驗比較了外源TCR表達水平。結(jié)果顯示，在MOI=100時，獲得了最高的外源性TCR表達效率。當MOI值進一步升高時，外源基因表達效率反而有所下降，同時細胞數(shù)與對照組及較低MOI濃度組相比有所減少。這可能是由于純化的病毒保存于高鹽緩沖液中，在轉(zhuǎn)染時加入病毒液體積過多將在病毒和細胞共孵育的過程中影響T細胞生長。

在以肝癌特異性TCR基因修飾后，我們將各組效應(yīng)細胞分別作用于不同的腫瘤細胞株。實驗結(jié)果顯示，TCR基因轉(zhuǎn)染有效地促進了T細胞針對AFP陽性的肝癌細胞HepG-2、SMMC-7721的特異性裂解百分比。證實肝癌特異性TCR基因轉(zhuǎn)染可有效賦予T細胞腫瘤抗原識別能力，進而充分活化并發(fā)揮CTL效應(yīng)殺傷抗原陽性腫瘤細胞。而TCR基因轉(zhuǎn)染對AFP陰性腫瘤細胞株沒有表現(xiàn)類似的促進腫瘤殺傷活性的效果，證實了TCR基因轉(zhuǎn)染良好的抗原特異性。同時，由不同MOI值感染T細胞引起的特異性TCR陽性細胞比例與T細胞殺傷靶細胞能力有較好的對應(yīng)關(guān)系。高特異性TCR陽性細胞組獲得了最高的靶細胞凋亡率，證實特異性TCR基因表達水平上升可有效促進T細胞識別和殺傷抗原陽性腫瘤細胞。

分析各組效應(yīng)細胞誘導AFP陽性腫瘤細胞凋亡情況，獲得了與CTL活性類似的結(jié)果。在TCR基因轉(zhuǎn)染T細胞后，誘導靶細胞凋亡比例顯著增加，與空載體轉(zhuǎn)染組和對照組相比差異有統(tǒng)計學意義。實驗同時比較了各組T細胞表面重要的促凋亡分子FasL表達情況。Fas-FasL是T細胞與腫瘤細胞相互作用的關(guān)鍵性分子［14］。T細胞可以通過細胞膜表面表達的FasL直接殺傷 Fas陽性靶細胞［15］。結(jié)果提示，在作用于AFP陽性表達的靶細胞HepG-2后，TCR基因轉(zhuǎn)染后T細胞表面FasL表達上調(diào)。T細胞表面表達上調(diào)的FasL分子將通過與靶細胞表面的Fas結(jié)合，激活靶細胞內(nèi)Caspase系統(tǒng)介導其凋亡［16］。

為分析T細胞抗腫瘤免疫反應(yīng)機制，實驗檢測了效應(yīng)細胞作用于靶細胞后細胞因子的分泌情況。TCR基因轉(zhuǎn)染促進了T細胞作用于AFP抗原陽性靶細胞后分泌IFN-γ的水平。而TCR基因轉(zhuǎn)染對T細胞分泌IL-2的能力沒有顯著影響。研究顯示，IFN-γ是CTL細胞介導抗腫瘤免疫反應(yīng)的關(guān)鍵細胞因子。而盡管IL-2能夠促進T細胞增殖，但是國外研究顯示，IL-2在CTL活化過程中主要意義是標記T細胞效應(yīng)分化，而非介導抗腫瘤免疫［17］。IL-2的缺乏不會影響T細胞抗腫瘤免疫功能。體內(nèi)實驗也證實，在用于過繼性回輸?shù)腡細胞中過表達IL-2不能改善其體內(nèi)存活能力和療效［18］。

綜上所述，本研究以重組腺病毒載體Ad5F35-TRAV-TRBV介導腫瘤特異性TCR基因成功轉(zhuǎn)染T細胞。在MOI=100時外源基因有最高表達效率。肝癌特異性TCR基因轉(zhuǎn)染可有效促進T細胞識別抗原陽性腫瘤細胞，并通過FasL-Fas途徑直接誘導腫瘤細胞凋亡，分泌IFN-γ等機制發(fā)揮更為強烈的抗腫瘤免疫效應(yīng)。

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