雷池月 鞏轉(zhuǎn)娣 韋 敏 歐陽霞輝 謝 坤 陳士恩 魏鎖成

(西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030)

促性腺激素釋放激素(Gonadotropin releasing hormone，GnRH)是生殖過程中最重要的激素，可促進(jìn)促黃體生成素(LH)和促卵泡刺激素(FSH)的合成與釋放［1，2］。GnRH 類似物(GnRH-A)具有與天然的GnRH相似的生理和生物學(xué)作用，而且與Gn-RH 受體(GnRHR)的結(jié)合力增強 100～200 倍［3，4］。阿拉瑞林(Alarelin，又名丙氨瑞林)是一種GnRH激動劑(GnRHa)，可以使肽的降解變慢，半衰期變長［5，6］，促進(jìn)垂體釋放 FSH［6］，其藥效為天然 GnRH的15倍，因此在臨床上得以廣泛應(yīng)用［7］。

國內(nèi)外學(xué)者用免疫組織化學(xué)技術(shù)對促性腺激素釋放激素(GnRH)及其受體(GnRHR)在雞、馬、牛、猴子和豬等動物進(jìn)行了研究［8，9］，我們前期的研究表明，阿拉瑞林主動免疫雌兔可抑制垂體FSH-β mRNA表達(dá)，增大卵泡縱徑和橫徑、增大卵泡細(xì)胞的線粒體、透明度和微絨毛［10，11］。阿拉瑞林免疫可以抑制小鼠垂體FSHR的表達(dá)［12］。

生物信息學(xué)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)與醫(yī)學(xué)各個領(lǐng)域，已成為生物醫(yī)學(xué)發(fā)展必不可少的部分。隨著人類基因組計劃的飛速發(fā)展，生物信息學(xué)技術(shù)已經(jīng)在人類疾病的研究、識別功能基因、基因與蛋白的表達(dá)、蛋白的功能研究等方面都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［13］。目前尚不清楚 FSHR在綿羊各種組織中的定位與分布［14］，尤其是用促性腺激素釋放激素類似物(GnRH-A)免疫綿羊后對卵泡FSHR蛋白表達(dá)的作用很少見有報道，其機理尚不清楚其表達(dá)水平有何關(guān)系［15］。有鑒于此，我們在前期研究的基礎(chǔ)上［6，10，16］，用 qPCR 和Western blot測定了FSHR在綿羊垂體和卵巢中的表達(dá)及FSHR的生物信息學(xué)分析，以期為深入研究GnRH-A免疫調(diào)節(jié)動物機體發(fā)育和生殖功能的機理及合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 DNA聚合酶(美國AMERSCO公司);pMD 18-T Vector(TaKaRa公司);Sybr Green qPCR Master Mix(美國 Qiagen);M-MLV Rtase;PCR試劑盒和RT-PCR試劑盒(Invitrogen);FSHR兔抗羊多克隆抗體、β-actin單克隆抗體(美國Sigma公司);第二抗體為HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG抗體。正常羊血清，武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn);Step one plus型熒光定量PCR儀(美國ABI公司);Rayto-6000型酶標(biāo)儀(Rayto公司);Image Analyst 1.0圖像分析軟件。

1.2 實驗動物與抗原注射方法 見表1。5～6月齡健康母綿羊(Ovis aries)42只，體重(24.21±2.51)kg，隨機均分為6組(n=7)，分別標(biāo)記為 EG-Ⅰ、EG-Ⅱ、EG-Ⅲ、EG-Ⅳ、EG-Ⅴ和 CG(對照組)，經(jīng)檢驗組間和組內(nèi)均無顯著差異。預(yù)飼15 d后正式實驗。阿拉瑞林抗原的制備方法見參考文獻(xiàn)［17］。

1.3 樣本采集與處理 分別在0、7、14、21、28、35、45、60和70頸靜脈采血，立即以3 500 r/min離心15 min，分離血清，－20℃保存。于70 d綿羊頸動脈放血處死，無菌采集腺垂體和卵巢，用電子天平稱重，迅速－80℃保存。

1.4 引物的設(shè)計 從GenBank中獲得綿羊FSHR mRNA(L12767.1)序列，用Premier 5.0軟件設(shè)計引物(由上海生工合成)。FSHR上游引物AGGGATGCGGTCGAACTGAGGT，下游引物 TGCAGCAGTGGAGACAGAATGACC;內(nèi)參用綿羊甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。

1.5 垂體總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增 將綿羊放血處死后，獲取綿羊的腺垂體，按照Trizol說明書提取總RNA。RT-PCR反應(yīng)采用25 μl體系。PCR條件是 94℃ 5 min，95℃ 2 min，95℃ 10 s，60℃ 40 s，循環(huán)40次;72℃ 10 min。RT-PCR反應(yīng)條件:95℃ 15 min，95℃ 30 s，55℃ 45 s，40 個循環(huán);70℃ 8 min。

1.6 PCR產(chǎn)物的克隆和測序 回收PCR產(chǎn)物并與pMD18-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞JM-109，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于LB平板，37℃下培養(yǎng)15 h，再接種于5 ml LB液體培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)12 h，采用堿裂解法提取出質(zhì)粒，對其進(jìn)行酶切鑒定，對鑒定結(jié)果為陽性的進(jìn)行序列測定。

表1 各組實驗綿羊抗原注射劑量和時間Tab.1 Doses and times for injecting GnRHa antigen in ewes

1.7 垂體FSHR mRNA實時熒光定量PCR(qPCR)

以實驗組 FSHR mRNA 的 2－ΔΔCt與對照組 2－ΔΔCt的比值計算其相對表達(dá)量，其中Ct表示基因擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，ΔΔCt=實驗組Ct(目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct)-對照組Ct(目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct)，2－ΔΔCt表示2的－ΔΔCt次方。實驗重復(fù)3次，計算平均值。

1.8 卵巢FSHR蛋白的Western blot檢測 取50 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)，電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉4℃過夜，用FSHR多克隆抗體(1∶200)和β-actin兔多克隆抗體(1∶1 000)孵育，再用辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG(1∶2 000)室溫孵育120 min，TBS洗滌3次，加入免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)，顯影、洗片、晾干。用凝膠圖像分析儀掃描照片。用Quantity One軟件(美國Bio-Rad公司)分析每個條帶的灰度值，灰度值為掃描條帶的積分光密度(IOD)。以FSHR條帶的灰度值與β-actin條帶灰度值之比值表示組織中FSHR的相對含量。

1.9 綿羊FSHR基因的生物信息學(xué)分析 用TM-pred、SignalP、DNAMAN、TargetP1.1、PSORT、Baser tools等在線工具及軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 垂體總RNA提取結(jié)果 如圖1所示。

圖1 垂體總RNA提取Fig.1 Total RNA extraction from pituitary of ewes

2.2 垂體FSHR mRNA實時熒光定量PCR相對定量 各實驗組垂體FSHR mRNA的2－ΔΔCt均低于對照組(圖2)，隨著阿拉瑞林抗原注射劑量的增加，EG-Ⅰ、EG-Ⅱ和 EG-Ⅲ的 2－ΔΔCt值逐漸下降;而且，EG-Ⅰ與 EG-Ⅳ、EG-Ⅱ和 EG-Ⅴ相比較，注射阿拉瑞林抗原 4次后 FSHR mRNA的2－ΔΔCt值分別低于注射2次后FSHRmRNA的2－ΔΔCt值，表明加大阿拉瑞林的注射劑量和增加注射次數(shù)均會抑制垂體FSHR mRNA的表達(dá)。

2.3 卵巢FSHR蛋白的Western blot表達(dá) 用Western blot檢測到卵巢組織中有FSHR表達(dá)(圖3)。與對照組比較，實驗組羊卵巢中FSHR表達(dá)量隨阿拉瑞林免疫注射劑量和次數(shù)的增多而增加，EG-IV(7.68±1.17)和 EG-V(8.09±1.25)顯著高于 CG(6.12±0.65)，即阿拉瑞林免疫增強FSHR蛋白的表達(dá)。

2.4 FSHR的生物信息學(xué)分析

2.4.1 綿羊FSHR的DNA屬性 將經(jīng)PCR擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄等得到的序列用 DANMAN進(jìn)行分析，得出FSHR的DNA屬性圖，表明FSHR具有蛋白屬性。FSHR由345個氨基酸構(gòu)成。

2.4.2 綿羊FSHR核苷酸構(gòu)成比例及理化性質(zhì)

FSHR核苷酸序列長度為1 091 bp，與NCBI報道的同源性為100%，總原子數(shù)11 675，由C 3 348，H 5 607，O 1 387，N 1 091，S 242 構(gòu)成。理論等電點5.05;在體外哺乳動物網(wǎng)織紅細(xì)胞中的估計半衰期是1.2 h，該蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)是47.75，屬于不穩(wěn)定蛋白;脂肪指數(shù)為30.61;疏水性平均值為0.836，這表明該蛋白是疏水性蛋白。

2.4.3 開放閱讀框分析 采用NCBI開放閱讀框ORF(Open reading frame)Finder程序，得出長780 bp的ORF，起始密碼子位于41 bp處，終止密碼子位于820 bp處，推測編碼129個氨基酸殘基。

2.4.4 FSHR蛋白的細(xì)胞定位、功能位點及氨基酸序列跨膜區(qū)預(yù)測 用PSORTⅡprediction(http://psort.nibb.ac.jp/form2.html)分析FSHR蛋白的細(xì)胞定位，結(jié)果表明用k-NN(Nearest Neighbors)k=9/23，細(xì)胞質(zhì)60.9%，細(xì)胞核26.1%，囊泡(Vacuolar)4.3%，高爾基體4.3%和過氧化物酶體4.3%。

圖2 FSHR在垂體的表達(dá)Fig.2 Expression of FSHR in pituitary of ewes

圖3 各組綿羊卵巢組織中FSHR蛋白表達(dá)量Fig.3 FSHR expression levels in ovaries of ewes immunized with alarelin

圖4 綿羊FSHR蛋白三級結(jié)構(gòu)Fig.4 Predicted tertiary structure of FSHR of ewe

2.4.5 FSHR的信號肽序列分析結(jié)果 經(jīng)SignalP 4.1在線工具分析表明FSHR無信號肽。其中C最大值為0.146(19位點)，Y最大值0.263(19位點)，S最大值0.650(1位點)，S值0.433(1～18位點)，D值 0.355(1～18位點)，Cutoff值 0.450。TargetP序列分析得出FSHR的線粒體轉(zhuǎn)運肽為0.144，信號肽為0.136，其他 0.726。NetoGlyc功能位點預(yù)測表明該蛋白序列不存在潛在糖基化。

2.4.6 FSHR蛋白三級結(jié)構(gòu)、α螺旋和β螺旋的分析 α螺旋Chou＆Fasman(http://www.expasy.ch/tools/protscale.html)最小0.671(56，57 位點)，最大1.289(818和819位點)。β螺旋最小為0.794(999和1 000位點)，最大為1.190(130位點)。應(yīng)用Swiss-Model程序預(yù)測FSHR編碼產(chǎn)物的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖4。

2.4.7 FSHR跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果 用http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)在線分析表明FSHR無跨膜區(qū)。應(yīng)用TMpred(http://embnet.vitalit.ch/softw-are/TMPRED_form.html)跨膜結(jié)構(gòu)軟件分析FSHR蛋白跨膜區(qū)域及方向，得出綿羊FSHR的TM螺旋長度為17～33，且從內(nèi)向外含有29個強跨膜螺旋區(qū)，從內(nèi)到外和從外到內(nèi)均有29個螺旋，N端外側(cè)含26個強跨膜螺旋。

3 討論

GnRH抗體特異性地中和動物體內(nèi)GnRH，從而影響FSH和LH的合成與分泌。阿拉瑞林與大分子免疫原性物質(zhì)(如BSA)結(jié)合后，具有良好的抗原性和免疫原性［18］。本文結(jié)果與筆者前期在家兔的研究一致［19，20］。然而，對阿拉瑞林免疫注射后激素受體mRNA的表達(dá)和分布是否發(fā)生改變迄今未見研究報道，其機理尚不清楚［21］。本實驗結(jié)果表明阿拉瑞林免疫可增加卵巢中FSHR蛋白表達(dá)。本研究結(jié)果與 Schirman-Hildesheim［22］和 Lopot 等［23］的報道一致。然而其分子機制有待深入探討［24，25］。

本研究運用生物信息學(xué)分析工具，對綿羊垂體FSHR進(jìn)行生物信息學(xué)特點分析，得出了FSHR的DNA屬性圖，得到了氨基酸數(shù)和氨基酸序列，得出核苷酸比例與分子量，F(xiàn)SHR核苷酸序列的核苷酸構(gòu)成、預(yù)測出了信號肽序列及三級結(jié)構(gòu)圖，脂肪指數(shù)、疏水性及穩(wěn)定性等生物信息學(xué)特點。這些研究結(jié)果使我們更深入的了解綿羊FSHR，為今后對FSHR的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供了科學(xué)數(shù)據(jù)平臺，為合理應(yīng)用GnRH類似物調(diào)節(jié)生殖功能和治療疾病提供了科學(xué)依據(jù)［14，15，26］。

綜上所述，阿拉瑞林免疫劑量依賴性的抑制垂體FSHR mRNA的表達(dá)，但是可以增加卵巢FSHR蛋白表達(dá)，體和卵巢FSHR表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。FSHR蛋白為不穩(wěn)定的疏水性蛋白。這對于提高母羊的繁殖能力具有重要意義。

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