何 穎 李淑梅 馬洪喜(長春大學音樂學院，長春 130022)

音樂可以鼓舞精神和激活大腦，引起強烈的快感和內(nèi)在獎賞系統(tǒng)的假定刺激，這表明音樂的存在有利于精神和軀體的健康［1，2］。近年來越來越多的人開始關(guān)注音樂對健康的影響，發(fā)現(xiàn)彈奏、聆聽和創(chuàng)作音樂幾乎能夠影響每個認知功能，因此音樂提供了研究神經(jīng)系統(tǒng)科學眾多方面的一個工具［3］。本實驗在聆聽音樂方面，通過音樂刺激老年大鼠，檢測血清、腦組織Caspase-3和Livin的水平，從神經(jīng)細胞凋亡方面探討不同類型音樂對大鼠神經(jīng)系統(tǒng)的作用機制為音樂治療的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑 健康老年雄性Wistar大鼠40只，20月齡，體重(360±20)g，由吉林大學白求恩醫(yī)學部動物實驗中心提供(動物許可證號:SCXK2007-吉大-0003);ELISA試劑盒購于南京建成生物有限公司;兔抗鼠Caspase-3和Livin一抗購于北京博奧森生物有限公司，SP和DAB試劑盒購于福州邁新生物有限公司;實時-PCR試劑購于塔克拉生物試劑有限公司。

1.2 實驗分組及實驗方法 健康老年雄性Wistar大鼠，隨機分為4組:空白對照組10只、莫扎特音樂組10只、梁祝音樂組10只和搖滾音樂組10只。每天上午水迷宮訓練同時音樂干預(yù)2 h，下午單純音樂干預(yù)2 h，音樂強度為65～85分貝連續(xù)7 d，第8天處死大鼠取血液及腦組織，待測試。

1.3 指標檢測

1.3.1 血清及腦組織海馬區(qū)中Caspase-3和Livin蛋白含量的檢測 采用ELISA法，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.2 腦組織海馬區(qū)中Caspase-3和Livin蛋白陽性表達的檢測 采用免疫組織化學法檢測，取腦組織固定于福爾馬林液中，包埋，切片4微米，60℃烤箱烘片4 h，然后脫蠟至梯度酒精至水洗，抗體稀釋液濃度均為1∶300，其余步驟嚴格按照說明書進行，DAB顯色后，用蘇木精復染，封片。采用Motic Image Advanced 3.2圖像分析儀，行半定量分析檢測灰度值，陽性表達越高灰度值越低，陽性表達越低灰度值越高。

1.3.3 腦組織海馬區(qū)中Caspase-3和Livin基因水平的檢測 采用實時熒光定量PCR法檢測，Caspase-3上游引物:5'-TGGAACAAATGGACCTGTTG-3'，下游引物:5'-AGGACTCAAATTCTGTTGCC-3'，擴增產(chǎn)物256 bp;Livin上游引物:5'-TCCACAGTGTGCAGGAGACT-3'，下游引物:5'-ACGGCACAAAGACGATGGAC-3'，擴增產(chǎn)物368 bp;β-actin上游引物:5'-CCTAAGGCCTAACCGTCGAA-3'，下游引物:5'-GGATGCCTAGGGCAGTAATC-3'，擴增產(chǎn)物 168 bp。

1.4 統(tǒng)計學分析 血清及腦組織中Caspase-3和Livin的蛋白含量、蛋白表達灰度值及基因變化水平，其實驗數(shù)據(jù)均表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，采用t檢驗分析。

2 結(jié)果

各組大鼠一般狀態(tài)均好，皮毛光滑、精神飽滿。

2.1 血清及腦組織海馬區(qū)中Caspase-3和Livin蛋白含量的比較 與對照組比較，莫扎特音樂組、梁祝音樂組大鼠血清及腦組織海馬區(qū)中Caspase-3蛋白含量降低、Livin蛋白含量升高均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，莫扎特音樂組和梁祝音樂組之間比較無顯著差異(P＞0.05);而搖滾音樂組大鼠血清及腦組織海馬區(qū)中Caspase-3和Livin蛋白含量均無明顯改變(P ＞0.05)，見表1。

2.2 腦組織海馬區(qū)中Caspase-3和Livin蛋白陽性強度的比較 與對照組比較，莫扎特音樂組、梁祝音樂組大鼠腦組織海馬區(qū)中Caspase-3蛋白陽性表達強度降低、Livin蛋白陽性表達強度升高均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，莫扎特音樂組和梁祝音樂組之間比較無顯著差異(P＞0.05);而搖滾音樂組大鼠腦組織海馬區(qū)中Caspase-3和Livin蛋白陽性表達強度均無明顯改變(P ＞0.05)，見表2，圖1、2。

2.3 腦組織海馬區(qū)中Caspase-3和Livin基因水平的比較 與對照組比較，莫扎特音樂組、梁祝音樂組大鼠腦組織海馬區(qū)中Caspase-3基因水平降低、Livin蛋白基因水平升高均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，莫扎特音樂組和梁祝音樂組之間無顯著差異(P＞0.05);而搖滾音樂組大鼠腦組織海馬區(qū)中Caspase-3和Livin基因水平均無明顯改變(P＞0.05)，見表2。

表1 各組大鼠血清、腦組織海馬區(qū)中Caspase-3和Livin蛋白含量的比較(n=10，)Tab.1 Comparision of Caspase-3 and Livin protein contents in serum and hippocampus of brain tissue(n=10，)

表1 各組大鼠血清、腦組織海馬區(qū)中Caspase-3和Livin蛋白含量的比較(n=10，)Tab.1 Comparision of Caspase-3 and Livin protein contents in serum and hippocampus of brain tissue(n=10，)

Note:Compared with control group，1)P ＜0.01.

Groups Serum(ng/ml)Brain tissue(ng/ml)Caspase-3 Livin 5±0.93 1.03 Mozart music 2.31±0.651)9.51±0.841)3.48±0.751)10.78±0.971)Liangzhu music 2.42±0.491)9.39±0.721)3.53±0.691)10.63±1.121)Rock music 3.09±0.84 8.24±0.68 4.22±0.57 9.4 Caspase-3 Livin Control 3.16±0.52 8.11±0.63 4.33±0.78 9.34±

表2 各組大鼠腦組織海馬區(qū)中Caspase－3和Livin蛋白陽性強度(灰度值)及基因水平的比較(n=10，)Tab.2 Comparision of Caspase-3，Livin protein levels(grey value)and real-time PCR in hippocampus of brain tissue(n=10，)

表2 各組大鼠腦組織海馬區(qū)中Caspase－3和Livin蛋白陽性強度(灰度值)及基因水平的比較(n=10，)Tab.2 Comparision of Caspase-3，Livin protein levels(grey value)and real-time PCR in hippocampus of brain tissue(n=10，)

Note:Compared with control group，1)P ＜0.01.

Groups Protein levels(grey value)mRNA Caspase-3 Livin Control 113.24±4.18 110.56±5.24 5.21±0.76 1 Caspase-3 Livin 2 10.22±1.01 0.13±0.98 Mozart music 140.45±5.021)90.15±3.911)4.43±0.611)11.37±1.061)Liangzhu music 136.28±4.671)90.59±4.661)4.55±0.591)11.14±0.881)Rock music 116.53±4.16 116.41±4.72 5.14±0.8

圖1 腦組織海馬區(qū)中Caspase-3的表達(免疫組織化學染色，×400)Fig.1 Caspase-3 expression in hippocampus of brain tissue(Immunohistochemical staining，×400)

圖2 腦組織海馬區(qū)中Livin的表達(免疫組織化學染色，×400)Fig.2 Livin expression in hippocampus of brain tissue(Immunohistochemical staining，×400)

3 討論

音樂訓練可減少因老齡化而造成的記憶力下降，青少年時期學過音樂的人，老了后在記憶和認知能力方面的測試要推遲十年老化［4］。老年人進行持續(xù)的音樂活動可提高思維能力，消除因年齡甚至因缺乏教育而帶來的負面影響，在這項研究中70名59～80歲的音樂家和非音樂家進行了神經(jīng)心理測驗和調(diào)查，在心理測試、視覺空間的判斷、言語記憶、回憶和機動靈活性方面，音樂家得分更高［5］。感知和處理音樂并不是后來才加到我們的認識上的，而是已經(jīng)在我們周圍很久，從我們神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)展的最初階段就存在的了［6］。音樂有一個生物學基礎(chǔ)，而且大腦對音樂有一個功能組織，許多大腦區(qū)域參與了音樂處理過程的特殊方面，無論是對基本的感知還是喚起的情感反應(yīng)，音樂家似乎具有額外的專門化作用，尤其是對一些大腦結(jié)構(gòu)的超發(fā)展，這些效應(yīng)表明了，音樂學習調(diào)節(jié)了大腦，增加了個體細胞的應(yīng)答和細胞的數(shù)目［7］。國內(nèi)外的研究表明特定的音樂對放松身心、振作精神、誘發(fā)睡眠等有實效，能提高機體學習記憶能力，能夠提高機體抗疲勞、抗衰老及調(diào)節(jié)機體的免疫機能，隨著對音樂和大腦研究的繼續(xù)，本實驗參照國內(nèi)外大鼠相關(guān)研究，采用音樂強度65～85分貝干預(yù)，研究音樂干預(yù)在神經(jīng)系統(tǒng)方面的調(diào)節(jié)機制［8-10］。

Caspase-3與Livin是神經(jīng)系統(tǒng)中重要的損傷與抗損傷因子。Caspase-3能促進細胞凋亡，使細胞正常死亡;而Livin的表達能夠抗細胞凋亡。Caspase家族是直接導致凋亡細胞解體的蛋白酶系統(tǒng)，在細胞凋亡的分子機制網(wǎng)絡(luò)中居中心地位?？勺饔糜谝恍┢渌腃aspase家族成員，并降解凋亡細胞中的某些成分，導致蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)放大，最終使細胞凋亡［11］。因此Caspase-3被稱為死亡蛋白酶，是哺乳動物細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶。大量實驗證明，如果在Caspase-3激活之前進行干預(yù)，可以有效抑制凋亡的發(fā)生［12］。近年用形態(tài)學或生化的方法均證實，衰老的腦組織神經(jīng)元細胞具有典型的凋亡特征;其凋亡與Caspase-3的激活有關(guān)，Caspase-3的表達水平可作為衡量神經(jīng)元損傷的客觀指標，其中海馬組織較皮層組織可能更為敏感。Livin是一類分子水平的抗細胞凋亡調(diào)節(jié)因子，它能夠鈍化宿主對感染的自殺反應(yīng)，有學者證明，Livin能夠直接抑制Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9 酶水解作用，可能阻止Caspases蛋白在細胞凋亡時執(zhí)行蛋白切除功能;Livin可引起Caspases蛋白的降解，還能通過抑制Caspases的活性途徑抗凋亡作用［13，14］。本實驗結(jié)果顯示，莫扎特音樂組、梁祝音樂組大鼠血清及腦組織中Caspase-3蛋白含量、蛋白表達和基因水平均較對照組降低有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，Livin蛋白含量、蛋白表達和基因水平均升高有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，莫扎特音樂組略好于梁祝音樂組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);而搖滾音樂組大鼠血清及腦組織中Caspase-3和Livin蛋白含量、蛋白表達和基因水平均較對照組無差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);提示:音樂干預(yù)可通過下調(diào)Caspase-3、上調(diào)Livin水平，抑制神經(jīng)細胞凋亡，對神經(jīng)系統(tǒng)具有保護作用，這一結(jié)果也為音樂治療選擇背景音樂方面提供了理論依據(jù)。

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