蔣聰利 鄔玉蘭 幸 鵬 楊平常 劉志剛(深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院過敏反應(yīng)與免疫學(xué)研究所，深圳 518060)

塵螨(HDM)是人們居住環(huán)境中接觸性和吸附性過敏原的重要來源之一，其中戶塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus)和粉塵螨(Dermatophagoides farinae)是主要螨種。通過皮膚反應(yīng)性測試、支氣管激發(fā)測試、血清檢測等方法鑒定螨特異性IgE和嗜堿性粒細(xì)胞組胺釋放，已證明塵螨與支氣管哮喘有緊密關(guān)系［1］。第1、2組過敏原是眾所周知的塵螨主要過敏原，但有20%的螨過敏性患者體內(nèi)無抗一組和二組過敏原的特異性IgE，而在塵螨體內(nèi)含量較低的其他部分過敏原有較高的IgE結(jié)合性，故需研究多種塵螨重組過敏原以制備出代表性的混合重組過敏原疫苗［2］。目前，粉塵螨中已報(bào)道有十六種過敏原(Der f 1-3，5-7，10，11，13-18，22，24)［3］。其中大部分分子量集中在14～60 kD之間，而Der f 11分子量為98 kD，是與肌肉相關(guān)的高分子量蛋白。國外報(bào)道認(rèn)為Der f 11是寄生蟲體內(nèi)的重要過敏原，可以作為塵螨過敏性疫苗制備的備用成分［4］。國內(nèi)暫無關(guān)于Der f 11的任何報(bào)道，本研究通過合成Der f 11基因，構(gòu)建其表達(dá)載體，大量表達(dá)出Der f 11蛋白，通過免疫印跡檢測塵螨過敏性患者血清內(nèi)特異性IgE，從而鑒定其免疫原性，為我國粉塵螨疫苗的標(biāo)準(zhǔn)化制備奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒載體和表達(dá)菌 質(zhì)粒載體pET-32a購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)，大腸埃希菌BL21(DE3)由深圳大學(xué)過敏反應(yīng)與免疫學(xué)研究所提供。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料 塵螨患者血清取自廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科，存放于－20℃冰箱備用。限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ和Bam HⅠ購自大連寶生物TaKaRa公司。生物素標(biāo)記的小鼠抗人IgE抗體及HRP標(biāo)記的鏈霉親和素均購自美國Southern Biotech公司。DAB底物顯色試劑盒購自凱基生物公司。

1.2 方法

1.2.1 基因合成和克隆載體的構(gòu)建 通過分析比對(duì)深圳大學(xué)與香港中文大學(xué)合作所測出來的粉塵螨全基因組序列，獲得粉塵螨Der f 11的基因序列，由華大基因公司合成該基因并連接至克隆載體pMD18-T。然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸埃希菌E-.coli Top10，酶切鑒定后將陽性克隆送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

將測序所得序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫推導(dǎo)其相應(yīng)氨基酸序列，對(duì)該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和相對(duì)分子量利用在線程序進(jìn)行評(píng)估(http://web.expasy.org/compute_pi/)。將克隆得到的粉塵螨Der f 11基因與GenBank公布的其他物種的同種蛋白的基因序列進(jìn)行同源性分析。

1.2.2 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒和酶切鑒定 將pMD18-T-Der f 11陽性質(zhì)粒與原核表達(dá)載體pET-32a分別用限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ和Bam HⅠ雙酶切，將Der f 11基因片段與pET-32a的酶切產(chǎn)物連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-Der f 11。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E.coli Top10，堿裂解法提取質(zhì)粒后用Eco RⅠ和Bam HⅠ進(jìn)行雙酶切，測序鑒定后用于誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2.3 重組蛋白Der f 11的表達(dá) 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32(+)-Der f 11轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸埃希菌BL21后，涂板培養(yǎng)過夜，挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃振搖過夜，取2 ml菌液至新鮮LB培養(yǎng)液中，37℃，200 r/min搖菌至OD600為0.6左右時(shí)，按體積比1∶1 000加入0.1 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，將轉(zhuǎn)速調(diào)至125 r/min，搖菌8 h后，4 ℃ 10 000 r/min離心5 min，收集細(xì)菌沉淀。超聲破碎后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測重組Der f 11蛋白的表達(dá)情況。

1.2.4 重組蛋白Der f 11的純化 參照美國GE公司Ni-NAT martrix柱使用說明，將收集的菌液經(jīng)超聲裂解，離心，將上清液以2 ml/min的流速上樣于預(yù)平衡好的Ni-NAT柱，上樣完畢后，先用平衡緩沖液充分洗柱，然后用40 mmol/L的咪唑緩沖液洗去雜質(zhì)蛋白。最后用300 mmol/L咪唑緩沖液對(duì)目的蛋白進(jìn)行洗脫，取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡分析(Western blot) 用15份粉塵螨過敏性患者的混合血清和單人份血清分別作為一抗。將獲得的純化后的重組Der f 11蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含3%胎牛血清的TBST 4℃封閉過夜;TBST洗后，與1∶5稀釋的患者血清37℃，孵育2 h;洗后，加入經(jīng)TBST(1∶2 000)稀釋的生物素標(biāo)記的小鼠抗人IgE抗體，37℃，孵育2 h;洗后，加入經(jīng)TBST(1∶5 000)稀釋的HRP標(biāo)記的鏈霉親和素，37℃，孵育2 h;充分洗滌后，用四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色，至條帶顯出后用蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。檢測Der f 11是否有免疫原性及其與塵螨過敏性患者的IgE結(jié)合率。

2 結(jié)果

2.1 粉塵螨Der f 11基因序列和測序鑒定 將酶切鑒定為陽性克隆的重組質(zhì)粒測序后，結(jié)果顯示:粉塵螨Der f 11基因開放閱讀框?yàn)? 631 bp，編碼876個(gè)氨基酸(圖1)。粉塵螨基因組測序發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)室克隆的Der f 11基因與GenBank上公布的屋塵螨Der p 11及熱帶無爪螨Blo t 11同源性為99%。

2.2 表達(dá)載體pET-32a(+)-Der f 11的構(gòu)建和酶切鑒定 將測序正確的Der f 11基因連接到pET-32a表達(dá)載體后，用EcoR I和BamHⅠ雙酶切鑒定陽性克隆，核酸電泳結(jié)果顯示與Der f 11的cDNA長度(2 631 bp)基本一致(圖2)，證明表達(dá)重組質(zhì)粒pET-32a(+)-Der f 11構(gòu)建成功。

2.3 重組Der f 11蛋白的表達(dá)和純化 將pET-32a(+)-Der f 11重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌BL21，用0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，采用Ni+柱親和層析的方法純化Der f 11蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳。結(jié)果顯示:分子質(zhì)量約118 ku處有外源蛋白條帶出現(xiàn)，且純化后純度較高，該蛋白條帶的分子質(zhì)量與Der f 11蛋白理論分子質(zhì)量基本相符(圖3)。

圖1 由粉塵螨Der f 11 cDNA序列推導(dǎo)出的氨基酸序列Fig.1 Deduced amino acid sequence from dust mite Der f 11 cDNA

圖2 表達(dá)載體ET32a(+)-Der f 11酶切鑒定Fig.2 Restriction enzymes digestion-analysis of recombin ant plasmidpET32-Der f 11

圖3 重組蛋白Der f 11的表達(dá)和純化Fig.3 Expression and purification of recombinant protein Der f 11

圖4 重組蛋白Der f5Der f 11的免疫印跡分析Fig.4 Western blot analysis of recombinant Der f 11

2.4 重組蛋白Der f 11免疫原性的鑒定 將該重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，進(jìn)行Western blot鑒定實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示:Der f 11重組蛋白能與患者血清的IgE發(fā)生特異性結(jié)合(圖4A)，在15份塵螨過敏性患者血清中，其中3份血清與重組Der f 11產(chǎn)生較明顯反應(yīng)(圖4B)。

3 討論

塵螨是引起變態(tài)反應(yīng)性疾病包括哮喘、鼻炎及過敏性皮炎的重要原因之一。國內(nèi)有研究者進(jìn)行了大規(guī)模人群的變應(yīng)原皮膚點(diǎn)刺檢測，塵螨過敏原陽性率明顯高于其他過敏原［5，6］。針對(duì)塵螨引起的過敏性疾病的治療方法中，特異性免疫治療法(SIT)是從病因?qū)W出發(fā)且能改變過敏性疾病自然病程的治療方法［7］。其中用粉塵螨疫苗進(jìn)行舌下免疫治療單一過敏性鼻炎患者和多過敏性鼻炎患者一年半至兩年內(nèi)均呈現(xiàn)顯著療效［8］，免疫療法能有效提高過敏性疾病患者的生活質(zhì)量和減少其患病天數(shù)。而重組過敏原是過敏原新型免疫治療和診斷方法發(fā)展的基礎(chǔ)，其最優(yōu)勢是能夠使疫苗標(biāo)準(zhǔn)化，得到可定量組分的平衡配方，從而免除非過敏原成分引起的炎癥等副作用［9］。粉塵螨Der f 11是分子量較高的副肌球蛋白，在羊痂螨蟲［10］、熱帶無爪螨中副肌球蛋白均被報(bào)道是一種免疫原性較強(qiáng)的重要過敏原，熱帶無爪螨中重組Blo t 11蛋白與過敏性患者血清中特異性IgE結(jié)合性較天然Blo t 11蛋白低，降低了其變應(yīng)原性［11］。國外學(xué)者報(bào)道了關(guān)于粉塵螨副肌球蛋白的cDNA序列及利用pGEX-2T表達(dá)載體在大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，其cDNA序列全長2 134 bp，編碼711個(gè)氨基酸［12］。而國內(nèi)尚未有關(guān)于中國地區(qū)粉塵螨體內(nèi)副肌球蛋白(Der f 11)的研究，本研究使用的粉塵螨Der f 11 cDNA基因序列全長為2 632 bp，可編碼876個(gè)氨基酸，通過同源性分析比對(duì)，與屋塵螨、疥螨、熱帶無爪螨等常見螨種同源性均高達(dá)99%。

將公司合成的粉塵螨Der f 11基因連接到pMD18-T載體上，經(jīng)雙酶切和測序均證實(shí)已獲得了正確的Der f 11基因。將該片段連接到原核表達(dá)載體pET-32a上，導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)內(nèi)，丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)后，經(jīng)SDS-PAGE分析，表明重組蛋白在宿主大腸埃希菌中能得到高效表達(dá)。利用pET-32a載體帶有His標(biāo)簽的特性，選用親和層析柱進(jìn)行純化，得到純度較高的蛋白后，使用15份塵螨過敏患者的混合血清進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明重組的Der f 11能和塵螨過敏患者血清中的IgE結(jié)合，說明重組變應(yīng)原具有較好的抗原性。將15份血清分別進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)后，其中3份血清顯示出明顯印跡條帶，過敏性患者血清中特異性IgE的結(jié)合率20%(3/15)，較國外50%的特異性IgE結(jié)合率低［12］，此原因可能是粉塵螨物種的地域性差異和采取的過敏性人群血清樣本的不同。此研究證明了粉塵螨Der f 11可作為塵螨疫苗制備的候選蛋白。

制備重組蛋白比天然蛋白周期短，成本低等優(yōu)點(diǎn)，本研究將粉塵螨Der f 11基因在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)，制備純化出具有天然免疫活性的重組蛋白Der f 11，為實(shí)現(xiàn)粉塵螨變應(yīng)原的標(biāo)準(zhǔn)化，特異性診斷和免疫治療奠定了基礎(chǔ)。

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