金權(quán)鑫 李芳芳 張辛軻 康榮學(xué) 王 榮 李紅花 金松竹 李英信 孟繁平

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與病原生物學(xué)教研部，延吉 133002)

重癥肌無力(Mysthenia gravis，MG)是以易疲勞和骨骼肌肌肉收縮無力為臨床特點(diǎn)的神經(jīng)肌肉接頭處(Neuromuscular junction，NMJ)的疾病。該病的發(fā)病機(jī)制和多種因素相關(guān)，目前研究較為確定的是由抗體介導(dǎo)的自身免疫性疾?。?］。大多數(shù)病例是通過對(duì)NMJ骨骼肌乙酰膽堿受體(Acetylcholine receptor，AChR)破壞使其數(shù)量降低引起。少部分病例是通過對(duì)NMJ肌肉特異性受體酪氨酸激酶(Muscle specific receptor tyrosine kinase，MuSK)產(chǎn)生抗體而破壞MuSK引起的［2］。除抗體因素外，環(huán)境因素，遺傳因素等均可參與MG的發(fā)病和病情的發(fā)展。

在NMJ的發(fā)育過程中，肌細(xì)胞膜上的AChR必須聚集在突觸后膜上，才能完成神經(jīng)肌肉的信號(hào)傳導(dǎo)。在AChR的聚集過程中，由運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末梢釋放的聚集蛋白(agrin)與其受體 MuSK結(jié)合，通過MuSK觸發(fā)肌細(xì)胞膜下另一種蛋白質(zhì)突觸受體相關(guān)蛋白(Receptor-associated protein at the synapse，rapsyn)，后者與AChR連接，使AChR聚集在突觸后膜上，作為乙酰膽堿的受體，開啟離子通道，引發(fā)動(dòng)作電位，完成肌肉收縮［3］。在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性MG的動(dòng)物模型(EAMG)中已經(jīng)證明，rapsyn基因的過度表達(dá)可防止AChR抗體介導(dǎo)的AChR丟失［4］，在先天性肌無力綜合征(CMS)患者中，也發(fā)現(xiàn)rapsyn的基因突變可導(dǎo)致AChR聚集障礙而引起肌無力，并發(fā)現(xiàn)了共同的突變基因［5］。本實(shí)驗(yàn)從MG患者外周血中提取基因組DNA并測(cè)定rapsyn 8個(gè)外顯子的基因序列，分析rapsyn基因單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與MG的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 試劑 全血基因組DNA小量試劑盒購于美國Axygen公司，PCR反應(yīng)試劑盒購于美國Promega公司。PCR擴(kuò)增rapsyn的8個(gè)外顯子基因引物均由大連寶生物公司合成。

1.2 樣本 患者組:MG患者132例，無親緣關(guān)系和家族史，漢族，年齡為3.5～73歲，平均年齡44歲，平均病程42個(gè)月，來自青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科、首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科、溫州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科和延吉市重癥肌無力研究所收治的患者。所有患者均符合MG的診斷標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)改良 Osserman臨床分型［6］，Ⅰ型、Ⅱa型、Ⅱb型、Ⅲ型和Ⅳ型均有。正常對(duì)照組:共153例，漢族，年齡為20～56歲，平均年齡45歲，均來自延邊大學(xué)附屬醫(yī)院體檢中心。對(duì)照組均要求排除自身免疫性疾病及其他慢性疾病。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集及基因組DNA的提取 根據(jù)知情同意原則，對(duì)照組和患者組均使用一次性肝素抗凝的真空采血管抽取5 ml肘靜脈血，1 500 r/min離心5 min，收集白細(xì)胞，于－20°C冰凍保存。按照全血基因組DNA小量試劑盒說明書進(jìn)行DNA的提取、純化。

1.3.2 PCR擴(kuò)增rapsyn 8個(gè)外顯子基因 應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件primer premier 5.0設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rapsyn 8個(gè)外顯子基因的8對(duì)引物，并在NCBI上的primer BLAST確定引物的特異性。PCR擴(kuò)增rapsyn 8個(gè)外顯子基因的引物序列及其產(chǎn)物長度如表1所示。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min，進(jìn)入35個(gè)循環(huán)(94℃變性 1 min，60℃退火 1 min，71℃延伸 1 min)后，再72℃延伸5 min。取5 μl PCR產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳檢查以確定條帶位置正確。PCR擴(kuò)增rapsyn 8個(gè)外顯子基因的引物序列及其產(chǎn)物大小如表1所示。

1.3.3 PCR產(chǎn)物測(cè)序和序列分析 PCR產(chǎn)物由上海申涑生物公司直接測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用NCBIBLAST分析。將PCR產(chǎn)物序列與野生型rapsyn基因序列(GenBank No.Z33905)進(jìn)行比較，分析rapsyn基因8個(gè)外顯子區(qū)SNPs。運(yùn)用SHEsis在線軟件(http://202.120.7.14/analysis/)進(jìn)行等位基因、基因型頻率計(jì)算、Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，進(jìn)行病例-對(duì)照關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果

2.1 rapsyn 第 1、2、4、5、6、7、8 外顯子基因序列經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)MG患者組和正常對(duì)照組rapsyn第1、2、4、5、6、7、8 外顯子基因序列與野生型 rapsyn 相應(yīng)基因序列完全相同，沒有發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。

表1 PCR擴(kuò)增rapsyn 8個(gè)外顯子基因的引物序列及其產(chǎn)物大小Tab.1 Primer sequences and product sizes of rapsyn exons amplified by PCR

表2 MG患者與正常人rapsyn基因新SNP L222R(T＞G)等位基因頻率和基因型頻率比較［n(%)］Tab.2 Genotype and allele frequencies of new SNP L222R(T＞G)of rapsyn gene in patients with myasthenia gravis and healthy individuals［n(%)］

表3 MG患者和正常人rapsyn基因新SNP L222R(T＞G)遺傳模式分析(%)Tab.3 Analysis of genetic model of new SNP L222R(T＞G)of rapsyn gene in patients with myasthenia gravis and healthy individuals(%)

表4 rapsyn基因8個(gè)外顯子核苷酸和氨基酸位置Tab.4 Places of nucleotides and amino acids in gene of rapsyn exons

2.2 rapsyn第3外顯子基因序列 經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)MG患者組和正常對(duì)照組rapsyn第3外顯子基因序列均存在多態(tài)位點(diǎn)，第665位堿基T突變成G(T665G)，氨基酸序列由相應(yīng)位置第222位亮氨酸(L)變成精氨酸(R)L222R［CTG＞CGG(2)］，將測(cè)序結(jié)果與rapsyn基因dbSNP數(shù)據(jù)庫比對(duì)，證明G位點(diǎn)是本次新發(fā)現(xiàn)的變異位點(diǎn)，G等位基因頻率在MG患者組和對(duì)照組分別為33.3%和34.3%(見表2)，也滿足SNP判斷的條件。SNP L222R等位基因頻率和基因型頻率在病例組和對(duì)照組均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(P＞0.05)。表2統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，G等位基因頻率在患者組和對(duì)照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，但3種基因型TT、TG、GG在患者組(42.4%V48.5%V9.1%)和對(duì)照組(49.0%V33.3%V17.6)存在顯著性差異，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。遺傳模式分析結(jié)果顯示，攜帶GG基因型對(duì)照組顯著高于患者組(P＜0.05)，表現(xiàn)為隱性模型特征(見表3)。

3 討論

rapsyn分子質(zhì)量為43 kD，由412個(gè)氨基酸組成，其 N-端 6～279位氨基酸為 7個(gè) TPR(Tetratricopeptide repeats)區(qū)，是直接與MuSK的細(xì)胞內(nèi)功能區(qū)結(jié)合部位［6］，TPR7區(qū)后還存在一個(gè)CC(Coiled-coil domain)區(qū)，是與AChRα亞單位的結(jié)合區(qū)。因此，rapsyn的7個(gè) TPR區(qū)和 CC區(qū)在誘導(dǎo)AChR聚集過程中極為重要。rapsyn的基因位于第11號(hào)染色體上，由8個(gè)外顯子編碼。其基因序列起始為47459314～47470729，共11 416個(gè)堿基，共有8個(gè)外顯子，7個(gè)內(nèi)含子，其基因結(jié)構(gòu)(NCBI.NC_000011.Reports Homo sapiens chrogi:51511727)如表4所示。

rapsyn與肌肉收縮無力之間的關(guān)系的研究最近幾年才開展起來，還未見到rapsyn與MG相關(guān)性研究的報(bào)道。在MG動(dòng)物模型的研究中發(fā)現(xiàn)，rapsyn在大鼠肌肉中的過度表達(dá)，可以抵抗AChR抗體對(duì)大鼠MG的誘導(dǎo)［4］。在先天性肌無力綜合征患者中，如果不是由于AChR各亞單位的基因突變引起的，往往可以檢測(cè)到rapsyn基因突變，而且最常見的突變是 N88K(位于 TPR3 區(qū))、L14P、G130E［5，7，8］。rapsyn基因突變后表達(dá)減少或穩(wěn)定性降低，誘導(dǎo)AChR聚集能力下降［9］。這使AChR更易遭受免疫因素(如AChR抗體)的攻擊，因此，rapsyn基因突變可能與MG的敏感性及疾病臨床嚴(yán)重程度相關(guān)聯(lián)，并可以解釋為什么有些MG患者實(shí)驗(yàn)室檢查AChR抗體含量很低，而患者的臨床癥狀卻很嚴(yán)重。

完整的rapsyn是由多個(gè)基因拼接而成，只有從肌肉組織中才能獲得完整的rapsyn cDNA。MG患者由于肌肉組織來源有限，因此從患者外周血白細(xì)胞染色體DNA中擴(kuò)增rapsyn基因的8個(gè)外顯子。在NCBI SNPs數(shù)據(jù)庫中尋找rapsyn基因資料，發(fā)現(xiàn)其8個(gè)外顯子中共存在91個(gè)突變位點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的132例MG患者中，rapsyn基因的第1、2、4、5、6、7和8外顯子均未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。在先天性肌無力綜合征患者中常見的突變位點(diǎn)N88K(位于第 2 外顯子)［5］、L14P(位于第 1 外顯子)［7］、G130E(位于第2外顯子)［8］在本項(xiàng)檢測(cè)的患者中也未發(fā)現(xiàn)有突變。在正常對(duì)照組中也未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)，表明這些突變位點(diǎn)不是本次檢測(cè)的中國漢族人群的SNPs。在rapsyn基因的第3外顯子中的 L222R［CTG＞CGG(2)］或T665G，正常對(duì)照組153人有78例發(fā)生堿基突變，等位基因G基因頻率為34.3%。MG患者組132人有76例發(fā)生堿基改變，等位基因G基因頻率為33.3%，滿足SNP判斷的條件。與rapsyn基因dbSNP數(shù)據(jù)庫比對(duì)證明，L222R［CTG＞CGG(2)］或T665G為本次新發(fā)現(xiàn)的SNP。其等位基因頻率和基因型頻率在患者組和對(duì)照組均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，證明本次研究選擇的樣本具有群體代表性。由于TT、TG和GG 3種基因型在患者組和對(duì)照組存在顯著性差異，即rapsyn基因SNPs與MG存在相關(guān)性，為了進(jìn)一步分析rapsyn基因SNP L222R在疾病發(fā)生中的遺傳模式，我們進(jìn)行了顯性和隱性遺傳模式比較，結(jié)果表現(xiàn)為隱性模型特征，提示rapsyn基因SNP L222R中G等位基因可能是MG的保護(hù)因子。目前我們正在進(jìn)行這一突變的氨基酸導(dǎo)致的rapsyn結(jié)構(gòu)改變以及可能引起的功能變化方面的研究，以解釋其對(duì)MG的保護(hù)機(jī)制。

遺傳因素中易感基因?qū)G的影響已引起國內(nèi)外研究者們的關(guān)注，近年來研究較多的MG易感的相關(guān)基因有雌激素受體(ESR-1)［10］、糖皮質(zhì)激素受體(GR)［10］、維生素 D 受體(VDR)［12］、蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型 22(PTPN22)［13，14］、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)［15，16］等，有些基因已經(jīng)證明與 MG 相關(guān)，有些則不相關(guān)。rapsyn基因突變與MG患者發(fā)病、病情嚴(yán)重程度及進(jìn)展之間到底存在何種相關(guān)的關(guān)系尚不清楚，但是隨著技術(shù)水平的不斷提高與大量實(shí)驗(yàn)研究的不斷進(jìn)展，更多的與MG相關(guān)性的基因新位點(diǎn)將被發(fā)現(xiàn)。

致謝:作者非常感謝青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科李海峰教授、首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科謝琰臣教授和溫州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科張旭教授為本實(shí)驗(yàn)提供重癥肌無力患者血液樣本。

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