鄭 桐 楊天飛 車筑平 譚慶華(貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴陽 550004)

近年來，隨著我國醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展，人均期望壽命已明顯延長，人口構(gòu)成的老齡化，高血壓病、冠心病及風(fēng)濕類疾病患者日益增加，NSAIDs如阿司匹林，臨床應(yīng)用越來越廣泛，該類藥物起治療作用的同時也產(chǎn)生了一些副作用，長期以來人們比較重視其引起胃十二指腸的損傷，但隨著腸鏡普及，發(fā)現(xiàn)NSAIDs引起的小腸副作用也并不低。最近研究表明服用NSAIDs的患者中有50%出現(xiàn)小腸黏膜破壞［1］。國內(nèi)外文獻對NSAIDs引起的腸道損傷的發(fā)病機制的報道并不多，所以探討其發(fā)病機制，制定相關(guān)的防治措施已成為重要課題。小腸黏膜上皮內(nèi)有多種產(chǎn)肽產(chǎn)胺的內(nèi)分泌細胞，其中D細胞見于小腸各段，分泌SST。NSAIDs相關(guān)性腸病是否有腸道黏液、SST、EGFR及PGE2的改變，這種改變與上皮組織的損傷和修復(fù)是否有關(guān)?需要實驗來明確。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 實驗動物為成年健康SD大鼠(重慶醫(yī)科大動物實驗室)32只，雌雄各半，體重(198.59±18.83)g，各組間在性別、年齡、體重上無顯著差別，飼養(yǎng)標準棒狀飼料，自由飲水，室溫(23±2)℃，12 h晝夜交替光照，實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。隨機分為四組，Ⅰ組(灌胃組)8只，精氨酸阿司匹林注射液灌胃;Ⅱ組(灌腸組)8只，精氨酸阿司匹林注射液灌腸;Ⅲ組(腹腔注射組)8只，腹腔注射精氨酸阿司匹林注射液;以上三組精氨酸阿司匹林注射液(海南靈康制藥有限公司，產(chǎn)品批號100601)用量為100 mg/kg，每天2次;Ⅳ組8只不采取任何干預(yù)措施，自由飲水，飲食，飼養(yǎng)2周后斷頸處死實驗動物后留取距回盲瓣5 cm的回腸組織保存于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 對回腸黏膜損傷進行評分 采用Chiu氏6級評分法［2］。0分:腸黏膜絨毛正常;1分:絨毛頂端上皮下出現(xiàn)囊狀間隙，并伴有毛細血管充血;2分:上皮下間隙擴大，中度固有層水腫，中央乳糜管擴張;3分:固有層明顯水腫，腸黏膜上皮層細胞變性、壞死，少數(shù)絨毛頂端脫落;4分:上皮細胞層變性壞死、脫落，部分絨毛脫落，固有層裸露，毛細血管擴張、充血;5分:絨毛脫落，固有層崩解。

1.3 阿利辛藍染色顯示回腸黏膜表面黏液 試劑配制:3%醋酸溶液:冰醋酸3 ml+蒸餾水97 ml。阿利辛藍溶液(pH2.5):阿利辛藍1 g+3%醋酸100 ml。0.1%核固紅溶液:核固紅0.1 g+硫酸鋁5 g+蒸餾水100 ml，硫酸鋁溶于水中，加核固紅，慢慢加熱到沸騰并把它冷卻過濾，并添加一粒百里香酚作為防腐劑。取石蠟包埋的各組動物末段回腸組織，切片、脫蠟至水，阿利辛藍著色30 min，自來水沖洗。0.1%核固紅溶液復(fù)染核5 min，自來水沖洗，脫水，封片，顯微鏡觀察。采用Image Pro plus圖像分析軟件進行半定量分析，每個樣本隨機檢測5個染色較好的高倍視野(×400)，計算黏液的陽性面積及積分光密度(IOD)，得出5個高倍視野的均數(shù)，即代表該樣本黏膜表面及杯狀細胞中的黏液IOD值。

1.4 ELISA檢測大鼠回腸SST、EGFR、PGE2 取上述回腸組織100 mg，剪碎為3 mm×3 mm大小，加入1ml PBS液，低溫勻漿，放入1.5 ml離心管，離心1 000 r/min，4℃，5 min，取上清液分裝待用。按試劑盒(活樂生物有限公司，上海)說明書操作。

1.5 免疫組化顯示SST、EGFR、PGE2 取石蠟包埋的各組動物末段回腸組織切片，脫水后行免疫組化染色。免疫組化一抗分別為:1∶200兔抗鼠SST單克隆抗體，兔抗鼠EGFR單克隆抗體，兔抗鼠PGE2單克隆抗體;二抗試劑盒，SP免疫組化檢測試劑盒及DAB顯示液，以上試劑均來自博奧森公司(北京，中國)。切片經(jīng)脫蠟至水，修復(fù)抗原、一抗、二抗程序作用后，加入酶標鏈霉卵白素復(fù)合物，DAB室溫顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，封片，顯微鏡觀察。以細胞質(zhì)及細胞膜染為棕黃色為陽性細胞。采用Image Pro plus圖像分析軟件進行半定量分析，每個樣本隨機檢測5個染色較好的高倍視野(×400)，計算陽性細胞IOD值，得出5個高倍視野的均數(shù)，即代表該樣本陽性細胞IOD值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS20統(tǒng)計軟件進行四組間秩和檢驗及Dunnett t檢驗，差異顯著性水平設(shè)定為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 肉眼觀察回腸標本，未發(fā)現(xiàn)明顯水腫、糜爛、潰瘍、出血、壞死、梗阻、穿孔等現(xiàn)象，見圖1。

圖1 回腸肉眼觀察Fig.1 Appearance of ileum

2.2 對回腸黏膜損傷進行評分 正常對照組腸黏膜損傷評分最小為0(P＜0.05)，Ⅰ組(灌胃組)為3.00±0.76，Ⅱ組(灌腸組)為 2.75±0.71，Ⅲ組(腹腔注射組)為2.88±0.64，三組阿司匹林腸黏膜損傷評分兩兩比較無差別。見表1。

表1 各組阿利辛藍的面積及積分光密度(IOD，)Tab.1 Area and IOD of Alcian blue was counted in each group(IDO，)

表1 各組阿利辛藍的面積及積分光密度(IOD，)Tab.1 Area and IOD of Alcian blue was counted in each group(IDO，)

Note:Compared with normal control group，1)P＜0.05;compared with oral intake group，coloclyster group，2)P＜0.05.

Normal control group Area 892.88±311.881)1 093.16±195.281)602.17±158.031)2)Oral intake group Coloclyster group Intraperitoneal injection group 802.48±99.34 1 757.79±345.83 IOD 408.20±155.111)521.81±175.531)249.54±113.191)2)

2.3 阿利辛藍染色顯示腸黏膜黏液分布及量變杯狀細胞位于黏膜層，散在于吸收細胞間，分泌黏液，杯狀細胞中的黏液及黏膜表面黏液與阿利辛藍結(jié)合后呈藍色(圖2)。在光鏡下正常對照組腸壁結(jié)構(gòu)清晰，黏膜上皮完整，絨毛排列緊密，杯狀細胞較多。三組阿司匹林組的腸壁結(jié)構(gòu)清晰，黏膜厚度變薄，黏膜上皮有脫落現(xiàn)象，絨毛萎縮變短，間隙增大，排列不整齊，黏膜腺體排列稀疏，杯狀細胞減少。測量杯狀細胞黏液的面積和IOD值均比正常對照組低(表1，P＜0.05)。三組不同給藥方式中，腹腔注射的面積及IOD值最低(P＜0.05)。

圖2 阿利辛藍染色回腸組織Fig.2 Ileal tissue sections were stained by Alcian blue

2.4 ELISA定量分析大鼠回腸SST、EGFR、PGE2灌胃組、灌腸組及腹腔注射組SST、EGFR水平與正常對照組無差異;灌胃組、灌腸、腹腔注射組的PGE2均數(shù)比正常對照組低(P＜0.05，表2)。

表2 ELISA檢測各組小腸SST、EGFR、PGE2水平Tab.2 Concentration of SST，EGFR and PGE2 were detected by ELISA

2.5 免疫組化顯示回腸黏膜SST、EGFR、PGE2分布(圖3)及量變(表3) 灌胃組、灌腸組、腹腔注射組SST和EGFR的IOD值與正常對照組比較無差異。灌胃組、灌腸組、腹腔注射組PGE2的IOD值均比空白對照組低(P＜0.05)，三組阿司匹林處理組中，三組間兩兩比較其水平?jīng)]有差異。

圖3 免疫組化顯示各組回腸SST、EGFR、PGE2分布Fig.3 SST，EGFR and PGE2 in ileum were detected by immunohistochemistry

表3 各組間SST、EGFR、PGE2的IOD值Tab.3 SST，EGFR and PGE2 were detected and IOD were measured in each group

3 討論

NSAIDs相關(guān)性腸病中典型的病理改變?yōu)樾∧c黏膜炎癥、糜爛、潰瘍、黏膜下層纖維增生，引起腸腔狹窄等［3］。本研究中，光鏡下可見腸黏膜糜爛，說明不同給藥途徑的治療量阿司匹林，均可肯定地引起大鼠小腸黏膜損傷。但沒有見到典型的大體損傷表現(xiàn)，分析其原因筆者認為:①造模時間不同。服用NSAIDs 6個月以上小腸炎癥發(fā)生率高達60%～70%，可并發(fā)小腸出血、蛋白丟失、吸收障礙以及小腸穿孔等嚴重并發(fā)癥［4］。何旭東等［5］通過對46例行膠囊內(nèi)鏡檢查的患者分析也發(fā)現(xiàn)NSAIDs所致的消化道損傷與服藥時間有關(guān)，服用時間越長，其發(fā)生率越高。②所使用的阿司匹林劑型不同。腸溶片及控釋片的藥物在小腸停留時間較長，故對小腸損傷較重，該劑型為注射液，進入大鼠體內(nèi)后聚集在小腸濃度較低故對小腸破壞不明顯。③阿司匹林不從膽汁排泄，因而無腸肝循環(huán)，不引起或者只引起輕微小腸黏膜損傷。這與黃文柱等［6］的報道相一致。④該藥臨床應(yīng)用較安全，現(xiàn)代制藥工藝的進步使得該藥物的副作用降低，這與羅佳等［7］研究發(fā)現(xiàn)阿司匹林與吲哚美辛、布洛芬和塞來昔布相比較對大鼠小腸黏膜損傷明顯減輕一致。

人類胃、小腸黏膜含有豐富的PGE2，它是小腸黏膜重要的保護因素。PGE2具有廣泛的生物活性，在抑制胃酸分泌，保護黏膜細胞等方面有著重要的作用。PGE2具有直接的血管擴張作用，增加腸道黏膜的血流量;在組織炎癥時，通過抑制炎癥細胞的黏附、抑制炎性細胞因子介導(dǎo)的細胞損傷等途徑，發(fā)揮其對黏膜細胞的保護作用。NSAIDs對胃、腸黏膜中PGE2的影響是早已明確的。NSAIDs可以通過以下幾方面引起小腸的損害［8-13］:①抑制前列腺素生成，主要通過抑制環(huán)氧化酶(Cyclooxygenase，COX)，COX存在3種異構(gòu)體，分別為COX-1、COX-2和COX-3。COX-1在各種組織中廣泛表達，主要起維持正常生理功能的作用。而COX-2在大多數(shù)正常組織中無表達，主要表達在炎癥部位巨噬細胞、成纖維細胞、上皮細胞和內(nèi)皮細胞等部位。COX-3可能是COX-2的異構(gòu)體，在體內(nèi)和離體實驗中均產(chǎn)生一些具有抗炎活性的因子。NSAIDs抑制COX2和COX1產(chǎn)生，從而抑制前列腺素產(chǎn)生。②局部作用，主要是腸劑或腸道控釋劑停留于腸道釋放高濃度的藥物，對腸黏膜局部刺激引起損傷。③引起腸道細菌移位，主要通過損害小腸上皮細胞引起上皮細胞通透性增加，使腸道菌群易于通過腸道黏膜屏障。④腸肝循環(huán)加重了NSAIDs對小腸的損害，膽汁結(jié)合的NSAIDs對小腸細胞有更強的損害，同時腸肝循環(huán)延長了NSAIDs與小腸黏膜接觸的時間。⑤近年有學(xué)者通過研究認為活性氧自由基的產(chǎn)生是NSAIDs吲哚美辛引起小腸損傷的機制之一［14］。結(jié)果顯示，通過不同途徑給予阿司匹林后，引起了小腸組織中 PGE2的明顯減少，與既往研究結(jié)果一致［8-13］。其中，各種給藥途徑所引起的 PGE2的變化無差異。

小腸上皮主要由吸收細胞、杯狀細胞和少量的內(nèi)分泌細胞構(gòu)成。杯狀細胞散在吸收細胞之間，其主要功能是分泌黏液，在吸收細胞表面形成一層黏液層。小腸黏膜的完整性和其表面的黏液層是小腸重要的物理、生物和化學(xué)屏障，避免腸腔內(nèi)有害物質(zhì)的侵入。而黏液量的多少與阿利辛藍染色的IOD值和厚度成正相關(guān)。灌胃組、灌腸組、腹腔注射組阿利辛藍染色面積及IOD值比正常組都低。提示阿司匹林注射液通過某種方式降低了小腸杯狀細胞合成和分泌黏液的能力。而三組不同給藥方式中，腹腔注射組的黏液量又最少，黏液分泌受抑制的程度與各組PGE2的變化無平行關(guān)系。說明PGE2只是影響?zhàn)ひ悍置诘闹匾蛩刂弧?/p>

SST是1973年首先從下丘腦分離出來的一個具有14個氨基酸的肽類激素，SST細胞在神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)都有大量分布。本文結(jié)果顯示灌胃組、灌腸組及腹腔注射組小腸組織中SST的濃度、IOD值無明顯變化。由于調(diào)節(jié)SST合成和分泌的因素較多，SST水平的無差異，提示我們影響SST合成和分泌的因素可能沒有受到影響，或是各種變化的因素之間相互抵消了引起的SST變化。其功能很多，除了可抑制胃腸分泌和胰腺的內(nèi)外分泌外，有免疫調(diào)節(jié)、腸道細胞保護等多種作用［15，16］。

SST與PGE2之間的相互作用也很復(fù)雜。SST可以通過抑制PGE2引起的腸黏膜分泌減少，抑制小腸黏膜碳酸氫鹽的分泌降低腸黏膜細胞的自身保護機制。而PGE2則可能增加小腸黏膜黏液的分泌量，增加黏膜中 SST的含量［17-19］，但這些功能都必須通過SST受體才能表現(xiàn)出來，所以SST水平的無變化，也不能排除SST沒有參與NSAIDs性腸道損傷的病理生理過程。

EGFR屬于跨膜受體酪蛋白氨酸蛋白激酶家族，可介導(dǎo)細胞的代謝、增殖、分化、黏附、遷移等生命現(xiàn)象。有研究表明在胃黏膜損傷修復(fù)中有EGFR的高度表達，對胃黏膜的保護及其損傷的修復(fù)有很重要的作用［20，21］。本文中灌胃組、灌腸組、腹腔注射組EGFR的濃度及IOD值均無明顯變化。這與蘆惠等［22］發(fā)現(xiàn)，腹腔注射 5 mg/kg內(nèi)毒素(Lipopolysaccharide，LPS)后，EGFR表達與回腸損傷程度無相關(guān)性相一致。因而推測可能是小腸的內(nèi)環(huán)境與胃的內(nèi)環(huán)境不同，在小腸的修復(fù)中有其他因素參與造成的，同時也說明了灌胃、灌腸及腹腔注射三種給藥方式對EGFR的影響無區(qū)別。

總之，阿司匹林在不同給藥途徑下，2周均可引起大鼠小腸黏膜的損傷。這種損傷中，小腸黏膜的完整性破壞和黏膜黏液的分泌受到了明顯影響，而腹腔注射給藥對小腸黏膜黏液的合成和分泌影響最大?？赡苓@些改變與PGE2的降低有關(guān)。無明確結(jié)果表明SST和EGFR參與了NSAIDs性腸病的病理生理過程，但不排除SST受體的變化影響了SST的作用。

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