陳東亞 陸羅定 俞 萍 卞 倩 徐 軍 楊明晶

(江蘇省疾病預(yù)防控制中心，毒理與功能評(píng)價(jià)所，南京 210009)

巨噬細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)的重要成員，具有吞噬、清除及呈遞抗原異物的生物學(xué)功能，是維持機(jī)體的正常生理狀態(tài)所必需的［1］。傳統(tǒng)的顯微鏡鏡檢記數(shù)法檢測(cè)巨噬細(xì)胞吞噬能力存在主觀性強(qiáng)、重復(fù)性差及耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的客觀性與準(zhǔn)確性。流式細(xì)胞儀技術(shù)用于巨噬細(xì)胞的吞噬率檢測(cè)可以輕易地將觀察細(xì)胞數(shù)從幾百上升至幾千，而且具有分析速度快、重復(fù)性好和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。熒光微球被細(xì)胞吞噬后，其熒光信號(hào)可迅速被流式細(xì)胞儀檢測(cè)，具有熒光信號(hào)的巨噬細(xì)胞即視為出現(xiàn)吞噬現(xiàn)象，可快速、準(zhǔn)確地測(cè)定巨噬細(xì)胞的吞噬率［2-5］?！侗＝∈称窓z驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范增強(qiáng)免疫力功能評(píng)價(jià)方法(征求意見稿)》中要求用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球試驗(yàn)替代巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)［6］，本研究的主要目的是在征求意見稿的基礎(chǔ)上，摸索最佳實(shí)驗(yàn)條件，從而使該方法能靈敏、穩(wěn)定的反映小鼠腹腔單核-巨噬細(xì)胞吞噬能力。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器 SPF級(jí)ICR小鼠，18～22 g，5～6周齡，雌性，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK(滬)2012-0002;羧酸鹽修飾熒光微球(F8827)為美國(guó)Invitrogen產(chǎn)品;牛血清白蛋白(Bovine serum albumin fractionⅤ，BSA)為美國(guó)AMERSCO公司產(chǎn)品，無支原體新生小牛血清為浙江天杭生物科技有限公司產(chǎn)品;Hank’s液為Gibco產(chǎn)品;PBS為實(shí)驗(yàn)室自行配制;流式細(xì)胞儀(BD Accuri?C6)為美國(guó)Becton Dickinson公司產(chǎn)品;金葵素膠囊(Jinkuisu capsule，JKS)由江蘇蘇中藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 預(yù)調(diào)理熒光微球 取熒光微球與1%BSA以1∶100體積比混勻，微球濃度為4.5×106個(gè)/ml，37℃避光孵育30 min，超聲處理5 min，臨用前配。

1.2.2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備 實(shí)驗(yàn)前4 d給每只小鼠腹腔注射0.2 ml 2%綿羊血紅細(xì)胞以激活小鼠巨噬細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天用頸椎脫臼法處死小鼠，腹腔注射加5%小牛血清的Hank＇s液5ml/只，輕輕按揉腹部20次，以充分洗出腹腔巨噬細(xì)胞，然后將腹壁剪開一個(gè)小口，吸取腹腔洗液2 ml用75 m(200目)過濾器過濾至試管內(nèi)，經(jīng)計(jì)數(shù)，腹腔巨噬細(xì)胞數(shù)為2 ×105～4 ×105ml－1。

1.2.3 吞噬實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 不同細(xì)胞濃度、微球濃度、孵育時(shí)間的摸索 三塊六孔板，上排每孔加1 ml制備的腹腔原液，下排每孔加1 ml經(jīng)Hank＇s液1∶1稀釋的腹腔液(巨噬細(xì)胞數(shù)為1×105～2×105ml－1)，每板第一列每孔加調(diào)理的熒光微球1.1 ml，第二列每孔加熒光微球2.2 ml，第三列每孔加3.3 ml，即微球濃度分別為5×106/孔、1×107/孔和 1.5×107/孔。分別于37℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱避光孵育1、1.5和2 h后，棄上清，每次使用2.0 ml 4℃PBS緩沖液輕輕洗滌2次，去上清后再加入4℃ PBS緩沖液0.5 ml，用細(xì)胞刮刮下貼壁細(xì)胞，輕輕吹打均勻后經(jīng)75 m過濾器過濾后上機(jī)分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.3.2 不同巨噬細(xì)胞消化方法 一塊六孔板，每孔加1 ml制備的腹腔原液和調(diào)理的熒光微球2.2 ml，于37℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱避光孵育1.5 h后，棄上清，每次使用2.0 ml 4℃PBS緩沖液輕輕洗滌2次，去上清后再加入4℃ PBS緩沖液0.5 ml，上排每孔加2 ml 0.25%Na2EDTA-胰酶消化液，下排每孔加2 ml 0.02%EDTA消化液，37℃消化30 min，棄消化液，上排加含5%小牛血清的Hank's液4 ml反復(fù)吹打，下排加不含血清的Hank's液4 ml反復(fù)吹打，收集細(xì)胞，1 500 r/min，5 min離心洗滌2次，重懸于0.5 ml 4℃ PBS緩沖液中，經(jīng)75 m過濾器過濾后上機(jī)分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 先在FSC和SSC二維散點(diǎn)圖選取巨噬細(xì)胞區(qū)域，在FSC-H和SSC-A圖中去除粘連體細(xì)胞，然后再以SSC和FL2(FITC)直方圖檢測(cè)FITC陽性的巨噬細(xì)胞，以此視作吞噬熒光微球的巨噬細(xì)胞，檢測(cè)5 000個(gè)靶細(xì)胞，F(xiàn)ITC陽性細(xì)胞比例即為巨噬細(xì)胞吞噬率(PP)，在直方圖中通過標(biāo)尺標(biāo)定未吞噬熒光微球的巨噬細(xì)胞群和吞噬熒光微球的巨噬細(xì)胞群，經(jīng)軟件分析未吞噬熒光微球的巨噬細(xì)胞和吞噬不同數(shù)量熒光微球的巨噬細(xì)胞的比例。吞噬指數(shù)(PI)=被吞噬的熒光微球總數(shù)/巨噬細(xì)胞總數(shù)，其中，被吞噬的熒光微球總數(shù)=吞噬1個(gè)熒光微球的巨噬細(xì)胞總數(shù)×1+吞噬2個(gè)熒光微球的巨噬細(xì)胞總數(shù)×2+吞噬3個(gè)熒光微球的巨噬細(xì)胞總數(shù)×3+吞噬4個(gè)熒光微球的巨噬細(xì)胞總數(shù)×4+吞噬5個(gè)熒光微球的巨噬細(xì)胞總數(shù)×5，以此類推。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)金葵素膠囊對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 40只ICR小鼠隨機(jī)分成4組，分別為陰性對(duì)照組、247、495、1 485 mg/kg BW 金葵素膠囊處理組，金葵素膠囊取內(nèi)容物用純凈水調(diào)配成受試濃度，灌胃容積為20 ml/kg BW，陰性對(duì)照組以等容積純凈水灌胃，連續(xù)灌胃30 d，按1.2.2方法獲取巨噬細(xì)胞，調(diào)整濃度至1×105～2×105ml－1，熒光微球濃度為1×107/孔，37℃孵育1 h后進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 雞紅細(xì)胞法檢測(cè)金葵素膠囊對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 按1.2.5方法進(jìn)行分組和灌胃，按《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》2003年版增強(qiáng)免疫力功能中方法進(jìn)行小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 吞噬百分率需進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，X=Sin－1，式中 P為吞噬百分率，所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS17.0單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球?qū)嶒?yàn) 流式細(xì)胞儀分析和數(shù)據(jù)獲取結(jié)果。圖1是流式細(xì)胞儀分析結(jié)果圖，圖1A為FSC和SSC單個(gè)細(xì)胞二維散點(diǎn)圖，R1為巨噬細(xì)胞，圖1B為FL2(FITC)直方圖，通過標(biāo)尺標(biāo)定吞噬熒光微球的巨噬細(xì)胞群。

2.2 不同細(xì)胞濃度、微球濃度、孵育時(shí)間對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)的影響 由表1可見，微球濃度越高，吞噬率和吞噬指數(shù)越大;細(xì)胞濃度為1×105～2 ×105ml－1，孵育時(shí)間 1.5 h，微球濃度為 1.5 ×107/孔時(shí)吞噬率(PP)和吞噬指數(shù)(PI)最高(89.87%，1.54)，孵育至2 h時(shí)出現(xiàn)下降(57.71%，1.51);細(xì)胞濃度對(duì)吞噬率和吞噬指數(shù)的影響與熒光微球濃度呈負(fù)相關(guān)。

2.3 不同巨噬細(xì)胞消化方法對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)的影響 貼壁巨噬細(xì)胞經(jīng)胰酶加EDTA消化后PP為44.51%，PI為0.68，單獨(dú)使用EDTA消化后PP為37.92%，PI為0.57，均低于使用細(xì)胞刮刀處理組。

2.4 金葵素膠囊對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 用流式細(xì)胞術(shù)法檢測(cè)金葵素膠囊對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(表2)，可見灌胃30 d后，中、低劑量組吞噬率和吞噬指數(shù)與對(duì)照組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但高劑量組吞噬率(PP)與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);雞紅細(xì)胞法檢測(cè)結(jié)果(表3)與流式法一致，說明流式細(xì)胞術(shù)法可以用于研究小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力，與傳統(tǒng)方法相比結(jié)果有一致性。

圖1 吞噬熒光微球后的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞FSC-SSC二維散點(diǎn)圖和FL2直方圖Fig.1 Dot-plot of FSC-SSC and histogram of FL2 of mouse peritoneal macrophages treated with fluorescent microspheres

表1 不同巨噬細(xì)胞濃度、不同微球濃度、孵育時(shí)間對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)的影響()Tab.1 Effects of different concentration of peritoneal macrophages，fluorescent microspheres and incubation time on phagocytosis()

表1 不同巨噬細(xì)胞濃度、不同微球濃度、孵育時(shí)間對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)的影響()Tab.1 Effects of different concentration of peritoneal macrophages，fluorescent microspheres and incubation time on phagocytosis()

Note:Compared with 5×106/well fluorescent microspheres，1 h group，1)P ＜0.05;compared with 2 h incubation time group，2)P ＜0.05;compared with 2 ×105 －4 ×105ml－1cell，1.5 h group，3)P ＜0.05.

Cell concentration Time/well 1.5×107 Concentration of fluorescent microspheres 5×106/well 1×107 PI 2×105－4×105ml－1 1 h 68.25±1.342) 1.20±0.21 73.98±1.972) 1.30±0.12 77.29±2.331)2)/well PP(%) PI PP(%) PI PP(%)8 57.71±1.68 1.51±0.13 1.35±0.15 1.5 h 73.47±1.872) 1.19±0.34 78.26±2.112) 1.26±0.18 80.63±1.342) 1.44±0.19 2 h 57.24±1.46 1.18±0.22 59.78±2.46 1.22±0.24 64.52±2.40 1.34±0.20 1×105－2×105ml－1 1h 72.06±1.162) 1.26±0.22 73.99±1.322) 1.25±0.23 77.04±1.242) 1.32±0.17 1.5 h 80.62±1.582) 1.35±0.21 82.57±2.102) 1.38±0.14 89.87±1.221)2)3)1.54±0.21 2 h 52.90±1.95 1.36±0.15 56.10±1.58 1.40±0.1

表2 流式細(xì)胞術(shù)法檢測(cè)金葵素對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(，n=10)Tab.2 Effect of JKS on influencing phagocytosis of mouse peritoneal macrophages by flow cytometry assays(，n=10)

表2 流式細(xì)胞術(shù)法檢測(cè)金葵素對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(，n=10)Tab.2 Effect of JKS on influencing phagocytosis of mouse peritoneal macrophages by flow cytometry assays(，n=10)

Note:Compared with control，1)P ＜ 0.05.

JKS/mg/kg PP(%)PI 1.18±0.15 Control 72.41±2.13 0.98±0.13 247 74.58±3.43 1.05±0.21 495 75.47±2.86 1.16±0.22 1 485 89.26±3.781)

表3 雞紅細(xì)胞法檢測(cè)金葵素對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(，n=10)Tab.3 Effect of JKS on influencing phagocytosis of mouse peritoneal macrophages by chicken red blood-cell method(，n=10)

表3 雞紅細(xì)胞法檢測(cè)金葵素對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(，n=10)Tab.3 Effect of JKS on influencing phagocytosis of mouse peritoneal macrophages by chicken red blood-cell method(，n=10)

JKS/mg/kg PP(%)PI Control 16.70±3.40 0.26±0.16 247 17.60±7.71 0.28±0.13 495 22.10±7.25 0.33±0.11 1 485 24.20±6.301)0.36±0.11

3 討論

本研究在征求意見稿的基礎(chǔ)上經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)，摸索了可能影響吞噬率和吞噬指數(shù)的實(shí)驗(yàn)條件:巨噬細(xì)胞濃度、微球濃度、孵育時(shí)間及酶消化方法。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，熒光微球的濃度對(duì)吞噬率有一定程度的影響，微球濃度越高，吞噬率越高?？梢娋奘杉?xì)胞的吞噬能力很強(qiáng)，不易達(dá)到飽和。但熒光微球濃度過高會(huì)增加實(shí)驗(yàn)成本，故而從經(jīng)濟(jì)角度出發(fā)，選用1×107/孔即已足夠。

2 ×105～4 ×105ml－1和1 ×105～2 ×105ml－1兩個(gè)濃度的巨噬細(xì)胞在1 h時(shí)吞噬率無顯著性差異，但當(dāng)細(xì)胞濃度1×105～2×105ml－1，微球濃度1.5×107/孔，孵育1.5 h時(shí)吞噬率與2×105～4×105ml－1組有顯著性差異，分析原因:1.5 h孵育結(jié)束時(shí)，由于2×105～4×105ml－1組細(xì)胞數(shù)過多，未稀釋的巨噬細(xì)胞組6孔板上清漂浮一層粘附有熒光微球的巨噬細(xì)胞，吸附在孔底的巨噬細(xì)胞沒有足夠的熒光微球吞噬，所以未稀釋的巨噬細(xì)胞的吞噬率低于低濃度的巨噬細(xì)胞。

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)熒光微球的吞噬率隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而增高，但1.5 h吞噬率達(dá)到最高，2 h時(shí)卻出現(xiàn)下降。與之前相關(guān)報(bào)道不一致［7］，推測(cè)可能是由于胞吞胞吐作用，吞噬了熒光微球的巨噬細(xì)胞排出了一部分熒光微球。但該理論還需要進(jìn)一步論證。綜上可見1×105～2×105ml－1細(xì)胞濃度，1×107/孔微球濃度，孵育1 h，可使實(shí)驗(yàn)快速而又精確的反應(yīng)巨噬細(xì)胞的吞噬率。

由于使用細(xì)胞刮刀將貼壁細(xì)胞刮下時(shí)易造成碎片過多，易抱團(tuán)等問題，故而嘗試使用酶消化法，但是試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞貼壁非常牢固，酶消化30 min無法充分消化，只能部分上清上機(jī)測(cè)試，導(dǎo)致吞噬率和吞噬指數(shù)偏低，不能準(zhǔn)確反應(yīng)巨噬細(xì)胞吞噬能力，且消化時(shí)間過長(zhǎng)，操作步驟多，對(duì)于大批量樣本檢測(cè)有難度，所以不推薦使用酶消化法。另外，腹腔原液吸出后建議放入硬質(zhì)塑料試管中，常用的1次性塑料軟試管巨噬細(xì)胞非常容易吸附，易導(dǎo)致細(xì)胞計(jì)數(shù)濃度和使用濃度相差太大，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

綜上所述，流式細(xì)胞術(shù)法檢測(cè)巨噬細(xì)胞吞噬能力的方法是可行的，優(yōu)化后能更快速、精確地反映巨噬細(xì)胞吞噬能力，與傳統(tǒng)雞紅細(xì)胞法相比結(jié)果具有一致性。后續(xù)研究需完善實(shí)驗(yàn)方法，并進(jìn)一步開發(fā)流式細(xì)胞儀在測(cè)定保健食品增強(qiáng)免疫力功能的應(yīng)用。

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