房彩霞，周 紅*，李貴芝，王德峰，王 綿

(1.河北醫(yī)科大學(xué) 第二醫(yī)院 內(nèi)分泌科， 河北 石家莊 050000；2.河北工程大學(xué) 附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科， 河北 邯鄲 056002)

RhoA/Rho激酶在2型糖尿病大鼠肝臟纖維化中的作用

房彩霞1，周 紅1*，李貴芝1，王德峰2，王 綿1

(1.河北醫(yī)科大學(xué) 第二醫(yī)院 內(nèi)分泌科， 河北 石家莊 050000；2.河北工程大學(xué) 附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科， 河北 邯鄲 056002)

目的闡明RhoA/Rho激酶在糖尿病大鼠肝纖維化中的作用。方法通過(guò)高脂飲食和小劑量鏈脲佐菌素(STZ，30 mg/kg)腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、糖尿病組和法舒地爾干預(yù)組(法舒地爾10 mg/(kg·d)，分兩次腹腔注射)24周末。測(cè)定血糖、血脂、谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶；Masson染色和羥脯氨酸測(cè)定評(píng)估肝膠原沉積；RT-PCR測(cè)定轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)mRNA表達(dá)；免疫組化測(cè)定TGF-β1蛋白表達(dá)；Western blot測(cè)定肝組織肌球蛋白磷酸酯酶靶點(diǎn)亞單位1磷酸化(p-MYPT1)水平。結(jié)果與對(duì)照組比較，糖尿病組大鼠血糖、血脂和轉(zhuǎn)氨酶顯著增高，肝組織大量膠原沉積，p-MYPT1水平、TGF-β1與CTGF mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(Plt;0.01)。與糖尿病組比較，法舒地爾干預(yù)組大鼠轉(zhuǎn)氨酶降低，肝膠原沉積明顯減輕，p-MYPT1水平、TGF-β1與CTGF mRNA表達(dá)顯著下降(Plt;0.01)。結(jié)論高血糖激活了肝組織RhoA/Rho激酶，通過(guò)調(diào)控 TGF-β1/CTGF表達(dá)，在糖尿病肝纖維化中起著重要作用。

糖尿病肝纖維化；Rho激酶；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；結(jié)締組織生長(zhǎng)因子；法舒地爾

糖尿病能夠引起多種慢性并發(fā)癥，除了大血管和微血管病變，糖尿病肝臟損傷，尤其肝纖維化已日益受到學(xué)者們的關(guān)注。糖尿病引起的肝臟病變?cè)谠缙谥饕憩F(xiàn)為非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver NAFLD)，進(jìn)一步發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis NASH)，肝纖維化，甚至進(jìn)展為不可逆轉(zhuǎn)的肝硬化[1]。糖尿病肝臟病變的分子機(jī)制還不十分明確，臨床上除了對(duì)代謝的改善，尚未找到能夠阻止肝病發(fā)生、發(fā)展的有效藥物。Rho是小分子的鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白，Rho激酶(ROCK)是RhoA下游最主要的效應(yīng)分子。近年的研究發(fā)現(xiàn)RhoA/ROCK信號(hào)通路的過(guò)度激活參與了多種組織結(jié)構(gòu)的重塑[2-4]，并且在糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起了重要作用[5]。研究也證實(shí)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1 TGF-β1)能夠激活肝星狀細(xì)胞并促進(jìn)表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)，在肝臟損傷中發(fā)揮著重要作用[6-7]。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor CTGF) 是TGF-β1的下游效應(yīng)器，TGF-β1的促組織纖維化作用可能是通過(guò)誘導(dǎo)CTGF的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的[8]。目前RhoA/ROCK通路與TGF-β1/CTGF通路的關(guān)系以及在糖尿病肝損傷中的作用國(guó)內(nèi)外尚為鮮見(jiàn)。

本研究通過(guò)高脂飲食結(jié)合小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin STZ，30 mg/kg)腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型，探討RhoA/ROCK在2型糖尿病肝纖維化中的作用，旨在為糖尿病肝臟病變的防治提供一個(gè)新的策略。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物及模型的建立：清潔級(jí)健康雌性SD大鼠[河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(冀)2012-1-003，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：1010399]42只，體質(zhì)量約180～200 g，按清潔級(jí)大鼠要求飼養(yǎng)。建立2型糖尿病模型[2]，10周末行高胰島素正常血糖鉗夾實(shí)驗(yàn)[9]。計(jì)算葡萄糖輸注速率(glucose infusion rate, GIR)，用以評(píng)價(jià)組織對(duì)胰島素的敏感性。取血測(cè)空腹血糖(FBG)、胰島素(FINS)、膽固醇(TC)和三酰甘油(TG)；每周測(cè)體質(zhì)量(BW)。將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(NC)、糖尿病組(DM)和法舒地爾干預(yù)組(FAS)(法舒地爾10 mg/kg·d, ip.)，繼續(xù)喂養(yǎng)14周。

1.2.2 血代謝指標(biāo)和肝功能測(cè)定：第24周末，取血測(cè)定FBG、FINS、TC、TG、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和糖化血紅蛋白(HbA1c)。根據(jù)公式計(jì)算胰島素抵抗指數(shù) HOMA-IR=FBG*FINS/22.5。

1.2.3 肝組織結(jié)構(gòu)和膠原沉積：快速取出肝臟，4%多聚甲醛溶液固定用于HE染色觀察肝組織結(jié)構(gòu)，Masson染色觀察膠原沉積。按照羥脯氨酸試劑盒說(shuō)明書要求測(cè)定膠原含量。

1.2.4 免疫組化檢測(cè)肝組織TGF-β1蛋白表達(dá)：一抗為兔抗大鼠TGF-β1抗體，1∶100稀釋，二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，陰性對(duì)照一抗用PBS緩沖液。按試劑盒說(shuō)明染色，中性樹(shù)膠封片。細(xì)胞內(nèi)有棕黃色顆粒彌漫分布者為陽(yáng)性反應(yīng)。

1.2.5 RT-PCR測(cè)定肝組織TGF-β1和CTGF mRNA表達(dá)：用Trizol提取肝臟組織總RNA，用Rotor-gene 3000熒光定量PCR儀測(cè)定A260/A280和RNA濃度。取3 μg RNA在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成單鏈的cDNA; 取1 μL cDNA在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。TGF-β1上游引物序列：5′-CCAAGGAGACGGA ATACAGG-3′；下游引物序列：5′-GTGTTGGTTGTA GAGGGCAAG-3′；擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為411 bp。CTGF上游引物序列：5′-GGCAGGGCCAACCACTGTGC-3′；下游引物序列：5′-CAGTGCACTTGCCTGGATGG-3′；擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為167 bp。β-actin上游引物序列為5′-GAGACCTTCAACACCCAGCC-3′；下游引物序列為5′-GCGGGGCATCGGAACCGCTCA-3′；擴(kuò)增產(chǎn)物全長(zhǎng)374 bp。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；PCR擴(kuò)增95 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸5 min。取PCR產(chǎn)物10 μL進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳35 min，凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度掃描。結(jié)果用目的基因與β-actin吸光度的比值表示。

1.2.6 Western blot測(cè)定磷酸化MYPT1(p-MYPT1)：肝組織勻漿，提取蛋白、電泳和轉(zhuǎn)膜。膜在室溫下用5%脫脂奶粉封閉液封閉1.0～1.5 h，加入TBS稀釋(1∶500)的兔抗大鼠磷酸化MYPT1(Thr696)多克隆抗體，并4 ℃孵育過(guò)夜，沖洗。加入熒光二抗(1∶10 000)，孵育2～4 h。用TBST洗膜后放入雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)上進(jìn)行分析，磷酸化MYPT1水平以p-MYPT1與MYPT1的比值表示。

國(guó)家之強(qiáng)弱，視教育發(fā)達(dá)與否為標(biāo)準(zhǔn)。東西各國(guó)規(guī)定義務(wù)教育，凡學(xué)齡兒童已達(dá)就學(xué)之期，非有不得已事故不得廢學(xué)，否則罪其父母，此教育之所以溥及而國(guó)乃以強(qiáng)盛。方今民國(guó)初定，百端待理，顧尤以普及教育為根本之要圖。而謀普及教育，須從調(diào)查學(xué)齡兒童入手，某地應(yīng)添設(shè)學(xué)校幾所，某地應(yīng)需經(jīng)費(fèi)若干，種種設(shè)施，皆恃是以為準(zhǔn)則。而以學(xué)齡兒童之人數(shù)比較就學(xué)差數(shù)之多少，尤足覘各地文化之遲速。[13]

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血生化指標(biāo)和BW

10周末，糖尿病大鼠FBG、FINS、TG、TC和BW顯著高于對(duì)照組(Plt;0.01，Plt;0.05)(表1)。24周末，糖尿病組大鼠的FBG、FINS、TG、TC、HbA1c、ALT和AST較對(duì)照組大鼠顯著升高(Plt;0.01)，法舒地爾干預(yù)組大鼠的FBG、FINS、TG、TC和HbA1c與糖尿病組大鼠無(wú)差異，但ALT和AST較糖尿病組大鼠顯著降低(Plt;0.01)；糖尿病組大鼠的BW較對(duì)照組大鼠顯著降低(Plt;0.05)，與法舒地爾干預(yù)組大鼠無(wú)差異(表2，3)。

2.2 胰島素敏感性指標(biāo)

第10周末，血糖鉗夾實(shí)驗(yàn)顯示糖尿病大鼠GIR顯著低于對(duì)照組大鼠(Plt;0.01)(表1)。第24周末，糖尿病和法舒地爾干預(yù)組大鼠的HOMA-IR顯著高于對(duì)照組(Plt;0.01)；糖尿病組和法舒地爾干預(yù)組大鼠HOMA-IR無(wú)差異性(Pgt;0.05)(表2)。

2.3 HE染色結(jié)果

對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列整齊，中央靜脈周圍呈放射狀分布。肝細(xì)胞大小、形態(tài)正常，核結(jié)構(gòu)清晰；糖尿病組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝索排列紊亂，肝細(xì)胞明顯腫脹，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大小不等的球形脂滴，呈空泡變性，伴有炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，中央靜脈周圍可見(jiàn)纖維組織增生；法舒地爾干預(yù)組上述改變均較糖尿病組明顯減輕(圖 1)。

表1 10周末各組大鼠血生化、GIR和BW指標(biāo)Table 1 Changes of biochemical index, GIR and BW at week 10(±s, n=6)

*Plt;0.05，**Plt;0.01 compared with control rats.

表2 24周末各組血生化指標(biāo)Table 2 Changes of biochemical index at week 24(±s, n=8)

*Plt;0.01 compared with NC group.

2.4 Masson染色和膠原含量

對(duì)照組大鼠血管壁可見(jiàn)少量被染成綠色的膠原纖維；糖尿病組大鼠中央靜脈周圍可見(jiàn)大量膠原纖維，膠原面密度為0.083±0.109，顯著高于對(duì)照組的0.051±0.008(Plt;0.01)；法舒地爾干預(yù)組顯著回降至0.059±0.009 (Plt;0.01) (圖2)。糖尿病組大鼠肝臟膠原含量顯著高于對(duì)照組大鼠(Plt;0.01)；法舒地爾干預(yù)組大鼠的膠原含量顯著回降(Plt;0.01)(表3)。

2.5 免疫組化染色結(jié)果

對(duì)照組大鼠肝組織中TGF-β1呈弱陽(yáng)性表達(dá)。糖尿病組大鼠肝組織中TGF-β1廣泛表達(dá)，呈棕黃色顆粒，陽(yáng)性面積為0.231±0.104%，顯著高于對(duì)照組0.169±0.100%(Plt;0.01)；法舒地爾干預(yù)組顯著回降至0.178±0.08%(Plt;0.01)(圖3)。

2.6 基因表達(dá)結(jié)果

糖尿病組大鼠肝組織TGF-β1和CTGF mRNA表達(dá)較對(duì)照組顯著上調(diào)(Plt;0.01)；法舒地爾干預(yù)組大鼠肝組織TGF-β1和CTGF mRNA表達(dá)顯著回降(Plt;0.01)(圖4)。

2.7 蛋白表達(dá)結(jié)果

磷酸化MYPT1水平代表ROCK的活性。糖尿病組大鼠肝組織磷酸化MYPT1水平較對(duì)照組大鼠顯著增加(Plt;0.01)；法舒地爾干預(yù)組大鼠肝組織磷酸化MYPT1水平顯著回降(Plt;0.01)(圖5)。

A.control rats; B.diabetic rats; C.fasudil-treated rats圖1 肝組織HE染色特征Fig 1 The features of HE-staining in liver tissue of different groups (×200)

A.control rats; B.diabetic rats; C.fasudil-treated rats; Liver tissues from the diabetic rats show regions of fibrosis (blue) in the interstitium

圖2 肝組織Masson染色的結(jié)果Fig 2 The result of Masson-staining in liver tissue of different groups (×400)

*Plt;0.05，**Plt;0.01 compared with NC group；#Plt;0.01 compared with DM group.

A.control rats; B.diabetic rats; C.fasudil-treated rats; a brown color denotes positive staining圖3 肝組織TGF-β1免疫化學(xué)染色結(jié)果Fig 3 Immunostaining for TGF-β1 in the liver tissues of different groups (×200)

A.tThe expression of TGF-β1 mRNA in liver tissues; B.the expression of CTGF mRNA in liver tissues;*Plt;0.01 compared with NC group;#Plt;0.01 compared with DM group

3 討論

近年來(lái)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究都證實(shí)糖尿病可以促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生，發(fā)展。在糖尿病患者中，終末期肝病的死亡率比心血管疾病高[10]。本研究發(fā)現(xiàn)24周末，糖尿病組大鼠的ALT、AST水平顯著增高，肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯的脂肪變性及中央靜脈周圍大量膠原纖維沉積，且膠原含量顯著增加，這些結(jié)果都證實(shí)糖尿病大鼠發(fā)生了肝纖維化，這與Paradis等人的研究結(jié)果相一致[11-13]。

Rho是小分子鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白，是Ras超家族成員之一，起著“分子開(kāi)關(guān)”的作用。ROCK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，是RhoA下游最主要的效應(yīng)分子，通過(guò)促進(jìn)肌動(dòng)蛋白微絲骨架的聚合，調(diào)控著細(xì)胞收縮、黏附、遷移、形態(tài)改變以及增殖等多種生物學(xué)行為和功能，同時(shí)RhoA/ROCK通路位于多種信號(hào)分子的上游，調(diào)控著多種信號(hào)通路和基因表達(dá)[5]。有研究顯示RhoA/ROCK在肝星形細(xì)胞增殖及膠原合成中起了重要作用[14]。TGF-β1是最重要的促纖維化生長(zhǎng)因子，CTGF是TGF-β1的下游效應(yīng)器，介導(dǎo)了TGF-β1促細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)合成的負(fù)面效應(yīng)[15]。

The phosphorylation of MYPT1 (p-MYPT1) and total MYPT1 were measured by western blot analyses; The extent of MYPT1 phosphorylation was quantified by p-MYPT1/MYPT1;*Plt;0.01 compared with NC;#Plt;0.01 compared with DM

本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病組大鼠的肝組織MYPT1磷酸化水平升高，ROCK活性增強(qiáng)，同時(shí)糖尿病組大鼠肝組織TGF-β1 mRNA和蛋白表達(dá)增加，CTGF mRNA表達(dá)上調(diào)。應(yīng)用ROCK特異性抑制劑法舒地爾干預(yù)后，不僅抑制了ROCK的活性，也抑制了TGF-β1/CTGF的表達(dá)，改善了肝纖維化，肝功能亦恢復(fù)正常。這些結(jié)果提示高糖激活了肝組織上RhoA/ROCK通路，可能通過(guò)調(diào)控TGF-β1/CTGF的表達(dá)從而介導(dǎo)了肝纖維化的發(fā)生。有研究報(bào)道ROCK抑制劑Y-27632在CCl4介導(dǎo)的急性肝損傷能夠降低血清轉(zhuǎn)氨酶水平，通過(guò)抑制ROCK的活性起到了肝細(xì)胞的保護(hù)作用[16-17]。研究中還發(fā)現(xiàn)法舒地爾對(duì)糖尿病大鼠的血糖、血脂和胰島素抵抗沒(méi)有影響，這意味著法舒地爾的肝保護(hù)作用是不依賴于代謝改善的，這與糖尿病心肌纖維化和腎病的研究結(jié)果相一致[2, 4]。

本研究證實(shí)高糖激活了肝臟RhoA/ROCK通路，在2型糖尿病大鼠肝纖維化中起著重要作用，ROCK有可能成為糖尿病肝纖維化新的治療靶點(diǎn)。法舒地爾是目前唯一能應(yīng)用于臨床的ROCK抑制劑[18]，臨床研究正在證實(shí)法舒地爾在心、腦血管疾病方面的獲益，本研究為更深地理解和治療糖尿病肝臟病變提供了一個(gè)理論依據(jù)。

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The roles of RhoA/Rho kinase in hepatic fibrosis of rats with type 2 diabetes

FANG Cai-xia1, ZHOU Hong1*, LI Gui-zhi1, WANG De-feng2, WANG Mian1

(1.Dept. of Endocrinology, the Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000;2.Dept. of Endocrinology, Affiliated Hospital of Hebei University of Engineering, Handan 056002, China)

ObjectiveTo determine whether RhoA/Rho-kinase is involved in the pathogenesis of hepatic fibrosis in rats with type 2 diabetes.MethodsAn animal model of type 2 diabetes was developed by high fat diet combined with intraperitoneal injection of low-dose streptozotocin (STZ, 30 mg/kg, i.p.). At week 24, fasting blood glucose, triglycerides, cholesterol, aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase were measured. The deposition of collagen in liver was evaluated by Masson staining and the hydroxyproline determination. The mRNA expressions of transforming growth factor (TGF-β1) and connective tissue growth factor (CTGF) in liver tissue were assessed by RT-PCR. Immunohistochemistry staining for TGF-β1 was performed. The phosphorylation of myosin phosphatase target subunit 1(p-MYPT1) was measured by Western blot analysis.ResultsCompared with control rats, blood glucose, blood fat, aminotransferase and the deposition of collagen in the liver in the untreated diabetic rats were significantly increased (Plt;0.01); p-MYPT1 and TGF-β1 protein, the mRNA expression of TGF-β1 and CTGF was significantly enhanced (Plt;0.01). Compared with untreated diabetic rats, treatment with fasudil signi-ficantly decreased aminotransferase, deposition of collagen, p-MYPT1, mRNA expression of TGF-β1 and CTGF(Plt;0.01).ConclusionsHyperglycemia can activate the RhoA/Rho-kinase which maybe regulates TGF-β1/CTGF expression in liver tissues. RhoA/Rho-kinase plays an importent role in the development of diabetic liver fibrosis.

diabetic liver fibrosis；Rho-kinase; transforming growth factor beta 1; connective tissue growth factor; fasudil

2013-06-05

2013-10-09

河北省衛(wèi)生廳重大課題(20090007)

*通信作者(correspondingauthor)： zhoubs2013@163.com

1001-6325(2014)03-0332-07

研究論文

R 364.3

A