李 娜，李 琪，尤列·皮爾曼，維克多·科羅索夫，周向東*

(1.重慶醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 呼吸內(nèi)科， 重慶 400010； 2.俄羅斯醫(yī)學(xué)科學(xué)院 遠(yuǎn)東呼吸生理與病理中心， 俄羅斯 布拉戈維申斯克 675000)

研究論文

黏著斑激酶在機(jī)械壓力誘導(dǎo)的人氣道上皮細(xì)胞黏液分泌中的作用

李 娜1，李 琪1，尤列·皮爾曼2，維克多·科羅索夫2，周向東1*

(1.重慶醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 呼吸內(nèi)科， 重慶 400010； 2.俄羅斯醫(yī)學(xué)科學(xué)院 遠(yuǎn)東呼吸生理與病理中心， 俄羅斯 布拉戈維申斯克 675000)

目的探討?zhàn)ぶ呒っ?FAK)在機(jī)械壓力誘導(dǎo)的人氣道黏蛋白(MUC)5AC分泌中的作用。方法氣液相界面培養(yǎng)人支氣管上皮NHBE細(xì)胞，用Transwell壓力實(shí)驗(yàn)裝置間斷性施壓于NHBE細(xì)胞，黏著斑激酶(FAK)siRNA轉(zhuǎn)染NHBE細(xì)胞，Western blot法檢測FAK和p-ERK1/2蛋白含量，實(shí)時熒光定量PCR檢測MUC5AC mRNA表達(dá)，ELISA法檢測MUC5AC蛋白相對含量。結(jié)果與空白對照組相比，機(jī)械壓力能顯著升高M(jìn)UC5AC mRNA及蛋白含量及p-ERK1/2蛋白相對表達(dá)水平(均Plt;0.01)。FAK siRNA可顯著降低機(jī)械壓力所誘導(dǎo)的MUC5AC mRNA及蛋白含量的升高及p-ERK1/2蛋白表達(dá)(Plt;0.01)，但與轉(zhuǎn)染FAK siRNA對照組相比，機(jī)械壓力+轉(zhuǎn)染FAK siRNA組細(xì)胞表達(dá)MUC5AC mRNA及蛋白水平和p-ERK1/2蛋白相對水平仍然是增加的(Plt;0.05)，PD98059能顯著抑制機(jī)械壓力所誘導(dǎo)的MUC5AC mRNA及蛋白表達(dá)水平的升高(Plt;0.01)。FAK siRNA聯(lián)合AG1478作用于NHBE細(xì)胞則可顯著抑制機(jī)械壓力誘導(dǎo)的MUC5AC mRNA和蛋白表達(dá)(Plt;0.01)。AG1478單獨(dú)作用能有效降低由機(jī)械壓力所誘導(dǎo)的上述指標(biāo)的升高(Plt;0.05)，但與AG1478對照組相比差異仍具有顯著性。結(jié)論機(jī)械壓力誘導(dǎo)的MUC5AC高表達(dá)的信號傳導(dǎo)通路為ERK依賴的，F(xiàn)AK為ERK的上游信號分子。

黏著斑激酶；機(jī)械壓力；黏蛋白類；細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶

臨床中多種慢性氣道炎性反應(yīng)疾病(如COPD、哮喘等)往往伴有支氣管收縮及重塑產(chǎn)生的氣道狹窄，由此引發(fā)氣道內(nèi)壓力增高，氣道壁上皮細(xì)胞受壓增加[1]。而黏液高分泌作為這類疾病的突出病理表現(xiàn)，是疾病發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的重要影響因素。黏蛋白5AC(MUC5AC)是氣道上皮尤其是病理狀態(tài)下的主要黏蛋白表型，在氣道黏液高分泌疾病中最具代表性[2]。黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)能介導(dǎo)機(jī)械牽拉所導(dǎo)致的ERK1/2活化[3]。而ERK1/2是已知的多種刺激因素誘導(dǎo)MUC5AC表達(dá)和杯狀細(xì)胞化生的關(guān)鍵性酪氨酸激酶[4-5]。那么，F(xiàn)AK是否在機(jī)械壓力誘導(dǎo)的氣道黏液分泌的信號傳導(dǎo)通路中起作用呢？該研究中以FAK為切入點(diǎn)，研究機(jī)械壓力作用于氣道上皮細(xì)胞所產(chǎn)生的對氣道黏液分泌的調(diào)控作用及信號傳導(dǎo)機(jī)制，以期探明機(jī)械壓力在氣道黏液高分泌調(diào)控機(jī)制中作用及其分子機(jī)制，為控制疾病狀態(tài)下氣道收縮狹窄狀態(tài)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料

正常人氣道上皮NHBE細(xì)胞和BEBM培養(yǎng)基(均Clonetics公司)；DMEM培養(yǎng)基(Mediatech公司)；Transwell培養(yǎng)板(Corning公司)；RPMI培養(yǎng)基、胎牛血清、TRIzol試劑和抗β-肌動蛋白的單克隆抗體(Sigma公司)；脂質(zhì)體Oligofectamine(Invitrogen公司)；鼠抗MUC5AC 45M1單克隆抗體(Neomarker公司)；鼠抗FAK單克隆、鼠抗FAK磷酸化位點(diǎn)多克隆(抗FAK Tyr397)抗體、鼠抗磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(p-ERK1/2)單克隆抗體、表皮生長因子受體(EGFR)阻斷劑AG1478、p-ERK1/2抑制劑PD98059(Cell Signaling公司)；PrimeScript RT試劑盒(大連寶生物公司)；FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)(德國羅氏公司)；引物由(上海生工公司合成)；FAK siRNA和對照siRNA(Dharmacon公司)，F(xiàn)AK siRNA序列為：FAK1, NNGCAUGUGGCCUGCUAUGGA; FAK2, UUUGGCG GUUGCAAUUAAATT。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：NHBE細(xì)胞接種于組織培養(yǎng)瓶中，加入支氣管上皮細(xì)胞培養(yǎng)液[6]，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱孵育，常規(guī)換液培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合達(dá)70% ～ 80%時傳代，將培養(yǎng)好的2代或3代細(xì)胞接種到Transwell培養(yǎng)板中的多微孔聚碳酸酯膜上。Transwell培養(yǎng)板插入配套6孔板中，形成上、下室，加入1:1混合的支氣管上皮細(xì)胞培養(yǎng)液/達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基混合培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，上、下室培養(yǎng)液相同[6]。每2天更換培養(yǎng)液至細(xì)胞長滿纖維膜并融合，去掉上室培養(yǎng)液，建立氣液相界面供試驗(yàn)使用，繼續(xù)每2天更換下室培養(yǎng)液。

1.2.2 壓力實(shí)驗(yàn)裝置及分組：參照文獻(xiàn)[7-8]。Transwell培養(yǎng)板上室加上帶進(jìn)氣口的硅膠塞形成密閉小室，進(jìn)氣口連接氣泵，通過向上室內(nèi)輸送濕化的37 ℃、5% CO2的空氣，控制上室氣壓，而下室仍處于大氣壓，從而使得多微孔聚碳酸酯膜上的NHBE細(xì)胞受到跨細(xì)胞壓力。參照文獻(xiàn)[1,8]，氣液相界面培養(yǎng)14 d開始，采用30 cm H2O壓力作用于NHBE細(xì)胞，每天1 h，連續(xù)7 d，模擬慢性氣道炎性性疾病中氣道收縮時氣道上皮細(xì)胞受到的慢性機(jī)械壓力。

1.2.3 細(xì)胞分組：將形成氣液相界面的NHBE細(xì)胞分組處理：1)空白對照組：無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，不予任何刺激；2)機(jī)械壓力組：細(xì)胞每天予以30 cm H2O壓力作用1 h，連續(xù)7 d；3)轉(zhuǎn)染FAK siRNA對照組；4)機(jī)械壓力+轉(zhuǎn)染FAK siRNA組。

在探討ERK1/2在機(jī)械壓力誘導(dǎo)的MUC5AC mRNA及蛋白表達(dá)中的作用實(shí)驗(yàn)中，采用ERK1/2特異性抑制劑PD98059作為干預(yù)因素，將細(xì)胞分為以下4組：空白對照組、機(jī)械壓力組、PD98059對照組和PD98059+機(jī)械壓力組。

在探討FAK siRNA聯(lián)合EGFR特異性抑制劑AG1478對機(jī)械壓力誘導(dǎo)的MUC5AC mRNA和蛋白表達(dá)的影響的實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞分為以下6組：空白對照組、機(jī)械壓力組、AG1478對照組、AG1478+機(jī)械壓力組、FAK siRNA+AG1478對照組和FAK siRNA+AG1478+機(jī)械壓力組。

1.2.4 FAK siRNA、對照siRNA轉(zhuǎn)染：在轉(zhuǎn)染前1天將處于指數(shù)增長期的NHBE細(xì)胞按(1～2)×106個/mL的濃度在無血清條件下接種到培養(yǎng)板中，待細(xì)胞融合至40% ～ 50%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。操作步驟按照脂質(zhì)體Oligofectamine說明書進(jìn)行。參照文獻(xiàn)[9]，將FAK siRNA與Plus Reagent在Opti-MEM培養(yǎng)液中結(jié)合。用Opti-MEM培養(yǎng)液稀釋的脂質(zhì)體以10 μg/mL的濃度進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6～ 8 h后，將0.5倍容積的含20%血清的RPMI培養(yǎng)液加入到細(xì)胞中繼續(xù)轉(zhuǎn)染48 h。轉(zhuǎn)染后24～ 48 h于熒光顯微鏡下觀察熒光，以此鑒定轉(zhuǎn)染是否成功及轉(zhuǎn)染效率。

1.2.5 實(shí)時熒光定量PCR檢測MUC5AC mRNA的表達(dá)：細(xì)胞總RNA提取及濃度、純度鑒定按參考文獻(xiàn)[10]方法進(jìn)行。cDNA反轉(zhuǎn)錄按照PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。人MUC5AC(AF015521)引物序列為：上游5′-CTGGACATGACCTGTTACAGC-3′，下游5′-AGCTGGCCTTCTTGTGCACGC-3′。人GAPDH(NM_002046)引物序列為：上游5′-TGT TCGTCATGGGTGTGAACC-3′，下游5′-CATGAGTCC TTCCACGATACC-3′。按照試劑盒說明建立10 μL PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)參數(shù)為95 ℃變性10 min，95 ℃變性15 s, 55 ℃退火30 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt的方法分析目的基因mRNA的相對表達(dá)量。Ct是達(dá)到熒光閾值所需的循環(huán)數(shù)，ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組(Ct目的基因-Ct管家基因)-對照組(Ct目的基因-Ct管家基因)。

1.2.6 ELISA法檢測細(xì)胞分泌的MUC5AC蛋白含量：按參考文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行。

1.2.7 Western blot檢測FAK、p-ERK1/2蛋白表達(dá)：步驟按參考文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行(鼠抗FAK單克隆、鼠抗FAK磷酸化位點(diǎn)多克隆(抗FAK Tyr397)抗體、鼠抗p-ERK1/2單克隆抗體終濃度均為1∶1 000)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1FAKsiRNA轉(zhuǎn)染對NHBE細(xì)胞合成FAK蛋白的干擾效率

FAK1和FAK2 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞表達(dá)FAK蛋白相對含量分別為(0.28±0.03)和(0.32±0.04)，均顯著低于對照siRNA組的(0.68±0.06)(Plt;0.01)和未轉(zhuǎn)染對照組的(0.74±0.07)(Plt;0.01)(圖1)。由于FAK1 siRNA和FAK2 siRNA均有顯著干擾效率，故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用兩者結(jié)合的一個siRNA來進(jìn)行RNA干擾。

1.control group; 2.control siRNA transfected group; 3.FAK1 siRNA transfected group; 4.FAK2 siRNA transfected group圖1 Western blot檢測各組FAK蛋白的相對含量Fig 1 Relative contents of FAK protein in different groups tested by Western blot

2.2 機(jī)械壓力對FAK磷酸化的影響

機(jī)械壓力組細(xì)胞表達(dá)FAK磷酸化位點(diǎn)Tyr397蛋白相對含量(0.39±0.03)較空白對照組的(0.25±0.02)有顯著提高(Plt;0.05)(圖2)。

1.control group; 2.stress group圖2 機(jī)械壓力對FAK磷酸化的影響Fig 2 The effect of mechanical stress on phosphoryl- ation of FAK

2.3FAK在機(jī)械壓力誘導(dǎo)的MUC5ACmRNA及蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組相比，機(jī)械壓力能顯著升高M(jìn)UC5AC mRNA及蛋白含量(Plt;0.01)；FAK siRNA轉(zhuǎn)染則可顯著降低由機(jī)械壓力所誘導(dǎo)的上述指標(biāo)的升高(Plt;0.05)；但是，機(jī)械壓力+轉(zhuǎn)染FAK siRNA組細(xì)胞表達(dá)MUC5AC mRNA及蛋白水平較轉(zhuǎn)染FAK siRNA組仍然是增加的(Plt;0.05)(表1)。

表1 各組細(xì)胞MUC5AC mRNA相對值及蛋白含量

*Plt;0.05 compared with stress;**Plt;0.01 compared with control;#Plt;0.05 compared with FAK siRNA transfected control.

2.4FAK在機(jī)械壓力誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化中的作用

與空白對照組的(0.43±0.07)相比，機(jī)械壓力組細(xì)胞p-ERK1/2蛋白表達(dá)相對含量(0.79±0.05)顯著增加(Plt;0.01)；與機(jī)械壓力組相比，機(jī)械壓力+轉(zhuǎn)染FAK siRNA組細(xì)胞表達(dá)p-ERK1/2蛋白相對含量(0.60±0.04)顯著減少(Plt;0.05)；但是，與轉(zhuǎn)染FAK siRNA對照組的(0.41±0.02)相比，機(jī)械壓力+轉(zhuǎn)染FAK siRNA組細(xì)胞表達(dá)p-ERK1/2蛋白相對水平仍然是增加的(Plt;0.05)(圖3)。

1.control group; 2.stress group; 3.FAK siRNA transfected control group; 4.stress+FAK siRNA transfected group圖3 FAK在機(jī)械壓力誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化中的作用Fig 3 The effect of FAK in mechanical stress-induced ERK1/2 phosphorylation

2.5ERK1/2在機(jī)械壓力誘導(dǎo)的MUC5ACmRNA及蛋白表達(dá)中的作用

PD98059+機(jī)械壓力組細(xì)胞MUC5AC mRNA及蛋白相對表達(dá)水平與機(jī)械壓力組相比顯著降低(Plt;0.01)(表2)。

表2 各組細(xì)胞MUC5AC mRNA相對值及蛋白含量

*Plt;0.01 compared with control;#Plt;0.01 compared with stress.

2.6FAKsiRNA聯(lián)合EGFR特異性抑制劑AG1478對機(jī)械壓力誘導(dǎo)的MUC5ACmRNA和蛋白表達(dá)的影響

FAK siRNA聯(lián)合AG1478能夠顯著抑制單純機(jī)械壓力誘導(dǎo)的MUC5AC mRNA和蛋白表達(dá)(Plt;0.01)；AG1478單獨(dú)作用可顯著降低由機(jī)械壓力所誘導(dǎo)的上述指標(biāo)的升高(Plt;0.05)，但與AG1478對照組相比差異仍具有顯著性(Plt;0.05)(表3)。

表3 各組細(xì)胞MUC5AC mRNA相對值及蛋白含量

*Plt;0.05 compared with stress;**Plt;0.01 compared with control;#Plt;0.05 compared with AG1478 control.

3 討論

FAK在機(jī)械牽拉所導(dǎo)致的ERK1/2活化中起重要介導(dǎo)作用[12]。而ERK1/2是已知的多種刺激因素誘導(dǎo)MUC5AC表達(dá)和杯狀細(xì)胞化生的關(guān)鍵性酪氨酸激酶[4-5]。因此，F(xiàn)AK可能在機(jī)械壓力誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞MUC5AC表達(dá)中起信號傳導(dǎo)作用。

該研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)械壓力能夠誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞FAK最重要的自身磷酸化位點(diǎn)-酪氨酸位點(diǎn)Tyr397的磷酸化水平增高。小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，可以序列特異性與靶mRNA序列結(jié)合，導(dǎo)致特異性mRNA的降解，從而穩(wěn)定持續(xù)地維持較長時間的基因沉默[13]。該研究中所采用的FAK siRNA質(zhì)粒在實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)可特異性地成功下調(diào)NHBE細(xì)胞FAK蛋白的表達(dá)。研究同時發(fā)現(xiàn)，機(jī)械壓力能夠誘導(dǎo)NHBE細(xì)胞MUC5AC mRNA和蛋白及磷酸化ERK1/2蛋白的表達(dá)顯著增加，F(xiàn)AK siRNA則能夠有效降低但卻不能完全抑制機(jī)械壓力誘導(dǎo)的上述效應(yīng)，而ERK1/2特異性抑制劑PD98059卻能顯著并完全抑制機(jī)械壓力誘導(dǎo)的MUC5AC mRNA和蛋白的表達(dá)，提示機(jī)械壓力誘導(dǎo)的MUC5AC高表達(dá)的信號傳導(dǎo)通路為ERK依賴的，F(xiàn)AK為ERK的上游信號分子，但可能存在其他非FAK依賴的ERK激活信號通路。

支氣管收縮產(chǎn)生的氣道壓力增加可經(jīng)表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)信號通路完成細(xì)胞外機(jī)械信號向細(xì)胞內(nèi)化學(xué)信號傳導(dǎo)[14]，并參與調(diào)節(jié)絲分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號通路[7]。因此，EGFR可能是誘導(dǎo)ERK活化并最終導(dǎo)致MUC5AC表達(dá)增加的另一上游機(jī)械傳導(dǎo)通路。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，EGFR特異性抑制劑AG1478與FAK siRNA一樣單獨(dú)作用于NHBE細(xì)胞時能夠顯著降低但卻不能完全抑制機(jī)械壓力誘導(dǎo)的MUC5AC mRNA及蛋白的表達(dá)，而將兩者聯(lián)合作用于NHBE細(xì)胞則能完全抑制機(jī)械壓力誘導(dǎo)的MUC5AC的高表達(dá)，同時，ERK傳導(dǎo)通路上游部分的EGFR的活化在各種因素誘導(dǎo)的氣道黏液高分泌信號傳導(dǎo)通路中居中心地位[15]，因此，EGFR為另一重要的機(jī)械壓力誘導(dǎo)的ERK激活及MUC5AC表達(dá)的上游信號通路。

研究結(jié)果初步證實(shí)了FAK、EGFR所介導(dǎo)的機(jī)械壓力促人支氣管上皮細(xì)胞MUC5AC表達(dá)效應(yīng)，并進(jìn)一步闡明了ERK信號傳導(dǎo)通路在其中所起的作用，從而加深了對氣道黏液高分泌的機(jī)械傳導(dǎo)機(jī)制的了解，為慢性氣道炎癥性疾病防控提供一個新的研究思路。

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Effects of focal adhesion kinase on mechanicalstress-induced airway mucin hypersecretion by human bronchial epithelial cells

LI Na1, LI Qi1, Juliy M. PERELMAN2, Victor P. KOLOSOV2, ZHOU Xiang-dong1*

(1.Dept. of Respiratory Medicine, the Second Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400010, China;2.Far Eastern Scientific Center of Physiology and Pathology of Respiration, Blagoveschensk 675000, Russia)

ObjectiveTo explore effects of focal adhesion kinase on mucin(MUC)5AC hypersecretion induced by mechanical stress.MethodsNormal human bronchial epithelial (NHBE) cells were cultured at an air-liquid interface and exposed to chronic intermittent compressive mechanical stress via Transwell mechanical stress apparatus. Cells were treated with FAK siRNA. Western blot was performed to determine FAK and phosphorylation of ERK1/2 protein contents. Real-time PCR and ELISA were underwent to test MUC5AC mRNA and protein contents respectively.ResultsThe expression level of phosphorylation of FAK at Tyr397 (p-FAK-Y397) in mechanical

group was significantly higher than those in control group. Compared with the control group, mechanical stress significantly increased expressions of MUC5AC mRNA and protein contents and also the protein expression of p-ERK1/2(Plt;0.01). FAK siRNA significantly attenuated the stress-induced increase in MUC5AC mRNA and protein expression and also the protein expression of p-ERK1/2(Plt;0.01). But expression of MUC5AC mRNA and protein and p-ERK1/2 protein in mechanical + FAK siRNA group was still higher than those in FAK siRNA control group(Plt;0.05). PD98059 significantly decreased the stress-induced increase in MUC5AC mRNA and protein expression(Plt;0.01). Combination of FAK siRNA and AG1478 could significantly inhibit the stress-induced increase in MUC5AC mRNA and protein expression(Plt;0.01). AG1478 alone effectively decreased stress-induced MUC5AC mRNA and protein expression(Plt;0.05)，but when compared with AG1478 control group，the differences were still significant.ConclusionsThe signal transduction pathway of stress-induced overexpression of MUC5AC is ERK-dependent，F(xiàn)AK is one of the upstream signal molecules of ERK.

focal adhesion kinase；mechanical stress；mucins；extracellular signal-regulated kinase

2013-08-29

2013-11-22

國家自然科學(xué)基金(31201059，31171346)；國家自然科學(xué)基金中俄國際合作項(xiàng)目(31211120168)；重慶市衛(wèi)生局面上項(xiàng)目(2012-2-077)

*通信作者(correspondingauthor)： zxd999@263.net

1001-6325(2014)05-0589-06

R 363

A