史晨輝，王維山，李長俊，張振東，郭風(fēng)勁，陳安民*

(1.華中科技大學(xué) 同濟(jì)醫(yī)學(xué)院 附屬同濟(jì)醫(yī)院 骨科, 湖北 武漢 430030； 2.新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院 骨科， 新疆 石河子 832000)

研究論文

慢病毒介導(dǎo)uPA-siRNA重組表達(dá)載體的構(gòu)建及促進(jìn)兔軟骨細(xì)胞增殖

史晨輝1,2，王維山1,2，李長俊2，張振東2，郭風(fēng)勁1，陳安民1*

(1.華中科技大學(xué) 同濟(jì)醫(yī)學(xué)院 附屬同濟(jì)醫(yī)院 骨科, 湖北 武漢 430030； 2.新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院 骨科， 新疆 石河子 832000)

目的構(gòu)建篩選出靶向特異uPA-siRNA慢病毒表達(dá)載體，感染軟骨細(xì)胞后觀察其對軟骨細(xì)胞增殖及代謝的影響。方法根據(jù)siRNA原理設(shè)計(jì)、構(gòu)建4對靶向兔uPA siRNA序列(P1、P2、P3和P4)，用RT-PCR篩選出高效靶向的P2序列。各序列經(jīng)慢病毒包裝后，通過Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染入兔軟骨細(xì)胞后，用RT-PCR和Western blot法分別檢測uPA-siRNA對細(xì)胞內(nèi)uPA mRNA和蛋白表達(dá)水平的抑制效果，用CCK-8法檢測uPA-siRNA對軟骨細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果成功構(gòu)建4對uPA-siRNA序列并篩選出用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的高效靶向P2序列，各序列經(jīng)慢病毒載體包裝并成功轉(zhuǎn)染到原代軟骨細(xì)胞中，在感染復(fù)數(shù)(MOI)為100時(shí)感染率達(dá)到85%以上。P1、P2、P3和P4均可抑制軟骨細(xì)胞中uPA基因及蛋白的表達(dá)，但P2沉默效果最好，基因抑制率達(dá)到70%，感染后軟骨細(xì)胞的增殖受到促進(jìn)。結(jié)論成功構(gòu)建高效靶向uPA-siRNA慢病毒載體，證實(shí)其可穩(wěn)定轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞并高效抑制uPA基因表達(dá)并促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖。

siRNA；RNA干擾； 慢病毒載體；軟骨細(xì)胞；增殖

尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator, uPA)是絲氨酸蛋白水解酶家族的主要成員，其與uPA受體(urokinase-type plasminogen activator receptors，uPAR)形成復(fù)合物作用于生理、病理?xiàng)l件下的細(xì)胞遷移、組織修復(fù)、介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的水解、裂解膠原蛋白酶、激活其他蛋白水解酶以及直接降解細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜等過程，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和滑膜炎性反應(yīng)等密切相關(guān)[1-3]。近期研究證實(shí)絲氨酸蛋白酶在基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)介導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織降解過程中起著關(guān)鍵作用[4]，但作為其主要成員的uPA在OA病變的各類信號傳導(dǎo)通路中起何種作用目前仍未見相關(guān)研究。RNAi技術(shù)(RNA干擾)即轉(zhuǎn)錄后基因沉默，能特異性抑制轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，是一種快速關(guān)閉基因的新方法，目前已在功能基因組和基因治療的研究方面廣泛應(yīng)用[5]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用siRNA技術(shù)構(gòu)建針對兔uPA基因的靶向特異性慢病毒載體，并成功篩選出高效沉默uPA基因的靶序列，以期為進(jìn)一步研究uPA基因在骨關(guān)節(jié)炎病變中的作用實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2月齡2.2 kg雄性新西蘭兔[普通級，新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證號:SCXK(新)2003-0002，使用許可證號:SCXK(新)2003-0003]，大腸埃希菌菌株DH5A和293T細(xì)胞(石河子大學(xué)民族與地方病實(shí)驗(yàn)室保存)，Lentivirus-NC病毒液和pGLV-H1-GFP+Puro載體(上海吉瑪公司)。BamHⅠ、EcoRⅠ內(nèi)切酶(MBI Fermentas公司), Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、Trizol試劑、DMEM/F12培養(yǎng)基(Invitrogen公司)，Taq酶、質(zhì)粒抽提試劑盒(TaKaRa公司)，uPA抗體(Abcam公司)，CKK-8試劑盒(碧云天公司)。

引物合成：應(yīng)用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)uPA及內(nèi)參基因β-actin檢測引物，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。uPA引物：上游5′-ACTACATTGTCTACCTG GGTCGGTC-3′，下游5′-ATGCAAGATGAGTTGCTCC ACTTC-3′，擴(kuò)增長度86 bp；β-actin引物：上游5′-CAGGTCATCACCATCGGCAAC-3′，下游5′-GGATGT CCACGTCGCACTTCA-3′，擴(kuò)增長度133 bp。

1.2 方法

1.2.1 軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)： 取兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織，軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)過程參照文獻(xiàn)，軟骨細(xì)胞重復(fù)消化4次后接種于培養(yǎng)瓶，隔天更換培養(yǎng)液，倒置顯微鏡觀察、照相記錄細(xì)胞形態(tài)及貼壁生長情況，待細(xì)胞貼壁達(dá)到85%～90%后進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 uPA基因siRNA設(shè)計(jì)與合成： 根據(jù)GenBank中兔uPA基因序列(NM_001082011)，參照siRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則，利用GenePharma siRNA designer v3.0工具軟件設(shè)計(jì)并挑選出4個(gè)作用靶點(diǎn)，分別標(biāo)號P1、P2、 P3和P4，同時(shí)設(shè)置普適型干擾序列做陰性對照(NC)。siRNA鏈的結(jié)構(gòu)為正義鏈-環(huán)-反義鏈，每對siRNA鏈命名為S鏈和AS鏈。每組序列均按發(fā)卡結(jié)構(gòu)模式設(shè)計(jì)合成，并在其兩端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)黏端，可直接聯(lián)入酶切后的載體上(表1)。序列片段由上海吉瑪技術(shù)有限公司提供合成。

1.2.3 重組RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定： 按表1設(shè)計(jì)合成的寡核苷酸片斷經(jīng)稀釋后在退火反應(yīng)體系中形成雙鏈DNA片斷，利用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切PgLV-Hl-GFP+Puro載體使其線性化，回收純化線性化載體片斷，雙鏈DNA片段和線性化載體片斷進(jìn)行連接反應(yīng)后于平皿內(nèi)轉(zhuǎn)化新鮮制備的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后的平皿于37 ℃培養(yǎng)16 h后隨機(jī)挑選菌落作為PCR模板，然后利用PCR進(jìn)行陽性克隆的鑒定。測序送上海生工生物技術(shù)有限公司完成。

表1 設(shè)計(jì)合成的靶向uPA的siRNA序列Table 1 Details of digestion for different types of uPA-siRNA sequence

1.2.4 重組慢病毒顆粒包裝及滴度測定： 按Lipofectamine 2000使用說明將制備的uPA RNAi慢病毒載體及PMD2G包膜輔助質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染8 h更換為完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞上清并濃縮，利用逐孔稀釋法在293T細(xì)胞中測定并標(biāo)定病毒滴度，后置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。病毒滴?TU/mL)=(計(jì)數(shù)的熒光細(xì)胞數(shù)量/相應(yīng)稀釋倍數(shù))/0.01。

1.2.5 細(xì)胞感染及感染效率測定： 將包裝好的重組慢病毒顆粒按照不同的感染復(fù)數(shù)(MOI)分組感染軟骨細(xì)胞，MOI分別選取1、10和100共3組。感染6 h更換為完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)3 d后通過倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)GFP的表達(dá), 并用圖像分析軟件Imagepro-plus6.0分析病毒感染效率。

1.2.6 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中uPA-mRNA表達(dá)水平： 感染4 d后用Trizol試劑抽提細(xì)胞總RNA，以其為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板PCR擴(kuò)增uPA基因。引物由上海生工公司合成，real-time PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 15 s，變性95 ℃ 5 s，退火延伸60 ℃ 30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)，在每次延伸階段獲取吸光值。PCR反應(yīng)結(jié)束后，95 ℃變性1 min, 隨后冷卻至55 ℃，使DNA雙鏈充分結(jié)合，同時(shí)讀取吸光值制作熔解曲線。

1.2.7 Western blot檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中uPA蛋白表達(dá)水平： 細(xì)胞感染4 d后提取細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后利用10% SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移蛋白至NC膜，加注雙抗后，ECL顯影。應(yīng)用Lab Image Version2.7.1軟件分析各組條帶吸光度值,以β-actin為內(nèi)參照。

1.2.8 CCK-8檢測siRNA對軟骨細(xì)胞增殖能力的影響： 取生長狀態(tài)良好的軟骨細(xì)胞，按細(xì)胞1 000個(gè)/孔的數(shù)量鋪96孔培養(yǎng)板，感染軟骨細(xì)胞后24、48、72和96 h分別獲取細(xì)胞，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每孔加入CCK-8溶液10 μL，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h后應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測每孔450 nm波長附近的吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 載體構(gòu)建及陽性克隆的PCR鑒定

根據(jù)引物大小可知插入siRNA 片段的陽性克隆PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為384 bp, 而空載體克隆PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為322 bp(圖1)。PCR電泳結(jié)果顯示, 5個(gè)隨機(jī)克隆均為陽性克隆。siRNA載體質(zhì)粒測序結(jié)果顯示與預(yù)期siRNA序列一致, DNA測序鑒定結(jié)果顯示序列正確無突變(圖2)。

2.2 慢病毒包裝及其病毒滴度測定

慢病毒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞40 h后熒光顯微鏡下可見明顯的GFP表達(dá)(圖3)。病毒液的生物學(xué)滴度測定為1×108TU/mL。

2.3 慢病毒感染效率的檢測

隨著MOI的增加，慢病毒的感染效率也隨之增加，當(dāng)MOI為100時(shí)，感染效率可達(dá)85%以上(圖4)，完全符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

2.4 uPA-siRNA干擾效果驗(yàn)證

與陰性對照組(NC)和空載體組(blank)相比，96 h時(shí)各感染組在mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)量明顯減少，其中以P2組抑制效果最好(圖5,6)。

2.5CCK-8檢測siRNA對軟骨細(xì)胞增殖能力的影響

各組細(xì)胞的生長曲線如圖7所示，對照組從48 h開始其生長即被抑制，在96 h時(shí)抑制最為顯著(Plt;0.05)，而實(shí)驗(yàn)組軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖沒有受到抑制，其中P2序列的細(xì)胞增殖表現(xiàn)更為明顯。

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種以軟骨組織破壞為主要病理特征的漸進(jìn)性退行性病變，盡管目前已有大量臨床及基礎(chǔ)研究，但關(guān)于它病變的確切病理機(jī)制仍然不清。目前人們普遍認(rèn)為OA是組織創(chuàng)傷、代謝、基因、遺傳和免疫等多因素綜合作用的結(jié)果[6]，病理變化涉及軟骨組織、軟骨下骨及滑膜在內(nèi)的所有關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)。近年來的研究表明MMPs和uPA等蛋白水解酶在軟骨組織的降解代謝中起著關(guān)鍵作用，其中作用最為顯著的是MMP-3與uPA。文獻(xiàn)證實(shí)滑膜巨噬細(xì)胞分泌的uPA在OA早期病變中有著重要作用，其促進(jìn)滑膜組織大量分泌IL-1β， 后者參與滑膜炎性反應(yīng)加重并加速降解代謝過程，uPA也參與調(diào)控MAPK等信號通路的改變進(jìn)而影響軟骨組織的代謝過程，uPA還可以直接作用于軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解，更為重要的是uPA激活MMPs酶原， 與活化的MMPs共同促進(jìn)軟骨組織的降解[4,7-8]。因此通過抑制滑膜組織和軟骨組織中uPA的表達(dá)，可降低OA病變早期軟骨組織的降解性代謝。

A.P1 sequence vector; B.P2 sequence vector; C.P3 sequence vector; D.P4 sequence vector; 1.ddH2O negative control group; 2.control group; 3.DNA marker; 4～8.masccline colony group

圖1各序列酶切鑒定圖
Fig1IdentificationofrecombinantplasmidsofuPA-siRNA

圖2 插入DNA片段測序圖Fig 2 Sequenced map of uPA-DNA fragments

RNA干擾技術(shù)(RNAi)是近幾年來產(chǎn)生的新興生物技術(shù), 是一種簡單有效的代替基因敲除的有力工具，研究表明應(yīng)用微量的siRNA即可使其編碼致病基因產(chǎn)物的含量下降90%以上, 甚至可以達(dá)到完全基因敲除的效果[9-10]，在基因功能研究和基因治療上具有廣闊的應(yīng)用前景。但如何將RNAi片段成功轉(zhuǎn)染至原代目的細(xì)胞是目前運(yùn)用該技術(shù)的難點(diǎn)，但以往的化學(xué)方法和腺病毒載體法有著轉(zhuǎn)染效率低，轉(zhuǎn)染穩(wěn)定性差等問題。目前學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)慢病毒載體能夠成功克服上述問題, 其可高效感染目的細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)長期穩(wěn)定表達(dá)[11-12]。因此，構(gòu)建能高效、特異、靶向抑制uPA基因表達(dá)的siRNA是進(jìn)行OA病理機(jī)制與治療等相關(guān)研究的重要基礎(chǔ)。

A.P1 sequence vector; B.P2 sequence vector; C.P3 sequence vector; D.P4 sequence vector; E.NC sequence vector圖3 1 μL病毒原液感染293T細(xì)胞后GFP表達(dá)Fig 3 GFP expression level in 293T cells after infection by lentiviral particles(×200)

圖4 P3序列在不同MOI值下感染293T細(xì)胞、軟骨細(xì)胞72 h后的熒光圖

b.blank; N.NC; *Plt;0.05，**Plt;0.01 compared with NC, blank圖5 uPA PCR擴(kuò)增曲線及轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞uPA基因表達(dá)水平Fig 5 mRNA expression of uPA after infection by RT-PCR

*Plt;0.05，**Plt;0.01 compared with NC, blank圖6 96 h時(shí)uPA蛋白表達(dá)水平Fig 6 Protein expression of uPA after infection by Western blot and photodensitometry of Western blot(n=3)

*Plt;0.05，**Plt;0.01 compared with NC, blank圖7 CCK-8檢測siRNA對細(xì)胞增殖能力的影響Fig 7 The effect of uPA low expression on proliferation of chondrocyte

本實(shí)驗(yàn)選用軟骨細(xì)胞為研究對象，篩選并構(gòu)建了可高效靶向抑制uPA表達(dá)的特異性序列，經(jīng)RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測證實(shí)，uPA-siRNA慢病毒載體可高效感染軟骨細(xì)胞并穩(wěn)定表達(dá)，對軟骨細(xì)胞中uPA基因和蛋白表達(dá)有顯著沉默作用。應(yīng)用CCK-8法觀察到uPA-siRNA對軟骨細(xì)胞增殖能力有明顯的促進(jìn)作用。為深入研究uPA基因在骨關(guān)節(jié)炎病變中的作用及機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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Construction of uPA-siRNA lentiviralvector and its promotion on proliferation of rabbit chondrocytes

SHI Chen-hui1,2, WANG Wei-shan1,2, LI Chang-jun2, ZHANG Zhen-dong2,GUO Feng-jing1, CHEN An-min1*

(1.Dept. of Orthopaedics, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030; 2.Dept. of Orthopaedics, Medical College of Shihezi University, Shihezi 832008, China)

ObjectiveTo construct with the siRNA expression lentiviral vector ，to infect to chondrocytes and to identify its interference effect.MethodsFirst to obtain four different types of siRNA sequence (P1, P2, P3 and P4) from the targeted uPA gene of New Zealand rabbit based on siRNA theory. Secondly, to transfect the primary culturing cartilage cells of the New Zealand rabbit with P1, P2, P3 and P4 to observe the infection rate under fluorescence microscope, the expression of uPA-mRNA gene in cartilage cells by and expression level of the uPA protein in cartilage cells were examined. The effect of proliferation of chondrocytes were detected by CCK-8.Results

The four types of vectors were transfected into the primary culturing cartilage cells. The infection rate can be as high as 85% in the experiment when MOI=100. P1, P2, P3 and P4 were all capable of inhibiting expressing of the uPA gene and protein in chondrocytes. P2 had the highest silencing rate. The significant promotive effect of uPA-siRNA on the reproduction of chondrocytes was shown by CCK-8 test after infection 96 hours.ConclusionsThe most efficient targeting uPA-siRNA sequence was found after screening. The siRNA lentiviral vector can be transfected into the cartilage cells, and can further inhibit the expressing of the uPA gene and steadily, and enhance proliferation of chondrocytes.

siRNA；RNA interfering；lentiviral vector；chondrocyte；proliferation

2013-08-09

2013-12-20

國家自然科學(xué)基金(30960387,81260453)；兵團(tuán)醫(yī)藥衛(wèi)生重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目(2013BA020)；兵團(tuán)國際交流合作項(xiàng)目(2011BC004)

*通信作者(correspondingauthor)： anminchen@tjh.tjmu.edu.cn

1001-6325(2014)05-0602-08

R 684.3

A