聶 萌，李 闖，游 燕，崔全才，王 林*

研究論文

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應通路小分子抑制劑協(xié)同抗癌藥物對宮頸癌細胞的抑制作用

聶 萌1，李 闖1，游 燕2，崔全才2，王 林1*

(1.中國醫(yī)學科學院 基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院 基礎學院 生理系，北京 100005；2.北京協(xié)和醫(yī)院 病理科，北京 100730)

目的探討UPR信號通路中重要小分子的抑制劑EerI和4μ8C在宮頸癌中的作用。方法用免疫組化法檢測GRP78/BiP、P97、Ubiquitin和IRE1α在正常宮頸鱗狀上皮組織及不同臨床分期宮頸癌組織中的表達；不同濃度的小分子抑制劑EerI和4μ8C處理宮頸癌HeLa細胞，MTS法檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞凋亡；抗癌藥物硼替佐米(BTZ)和順鉑(CDDP)分別聯(lián)合抑制劑4μ8C和EerI處理HeLa細胞，MTS法檢測細胞的增殖。結(jié)果GRP78/BiP、P97、Ubiquitin和IRE1α在不同分期宮頸癌癌巢部位的表達水平較正常宮頸鱗狀上皮細胞有顯著升高(Plt;0.05)，且隨臨床分期的不同其表達也存在一定差異；抑制劑EerI和4μ8C呈劑量依賴的方式抑制HeLa細胞生長，促進其凋亡(Plt;0.05)；與單獨用藥處理相比，抑制劑EerI和4μ8C分別與BTZ和CDDP的聯(lián)合作用均可顯著提高HeLa細胞對兩種抗癌藥物的敏感性(Plt;0.05)。結(jié)論UPR通路小分子抑制劑與抗癌藥物BTZ和CDDP聯(lián)用具有協(xié)同抗癌活性，這為抗癌新藥研發(fā)和逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性提供了新的思路。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應；宮頸癌；小分子抑制劑；聯(lián)合用藥

在許多生理和病理條件下，如實體腫瘤核心部分細胞遇到缺氧、低酸和營養(yǎng)成分缺失等，這些都會誘導未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)聚集并導致細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡，引發(fā)未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)的激活，也稱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[1]。UPR通過IRE1α-XBP1、PERK-eIF2α 和ATF6通路調(diào)控腫瘤細胞的生存或凋亡[2]。有報道表明，在胃癌[3]、肝癌[4]和乳腺癌[5]等腫瘤中發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中分子伴侶GRP78/BiP表達被激活。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關性蛋白降解(ER-associated protein degradation，ERAD)通路中重要的功能分子Valosin-Containing Protein(VCP，又名P97)在食管癌[6]、結(jié)腸癌[7]和前列腺癌[8]中表達上調(diào)。本研究探討宮頸癌(cervical cancer)中UPR通路小分子抑制劑的抗癌活性及其與抗癌藥物硼替佐米(Bortezomib，BTZ)和順鉑(Cisplatin，CDDP)的協(xié)同作用，為宮頸癌的治療和抗癌新藥的研究提供靶點。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

使用北京協(xié)和醫(yī)院婦科宮頸癌患者的手術標本，年齡為28～56歲。選取不同臨床分期(0、Ⅰ和Ⅱ期)宮頸癌患者的典型病例。所有標本均經(jīng)病理證實。所有患者術前未接受放療,化療及激素等治療。所獲標本均征得患者知情同意。

1.2 主要試劑

宮頸癌HeLa細胞(北京協(xié)和醫(yī)學院基礎所蔣澄宇教授課題組惠贈)；免疫組織化學試劑盒(北京中杉金橋有限公司)；兔抗人IRE1α多克隆抗體和鼠抗牛Ubquitin單克隆抗體(Santa Ctuz公司)，p97/Cdc48 (哥本哈根大學Dr.Hartmann Peterson惠贈)，兔抗人GRP78/BiP多克隆抗體(巴傲德生物科技有限公司)；硼替佐米(Bortezomib，BTZ)(Selleck Biochemicals公司)；順鉑(Cisplatin，CDDP)，P97抑制劑Eeyarestatin-Ⅰ (EerI)和IRE1α抑制劑4μ8C(EMD Millipore公司)；MTS一步法細胞活力檢測試劑盒(Promega公司)；凋亡檢測試劑盒(BD公司)。

1.3 免疫組織化學染色法

將臨床標本用甲醛固定和石蠟包埋，切取厚度為4 μm。嚴格按照免疫組化試劑盒說明書的步驟進行操作，其中一抗的濃度依次是IRE1α(1∶50)、P97(1∶500)、Ubiquitin(1∶500)和GRP78/BiP(1∶50)。使用PBS代替一抗做陰性對照。最終經(jīng)DAB顯色，由蘇木精復染。

1.4 MTS法檢測HeLa細胞增殖活性

培養(yǎng)HeLa細胞至對數(shù)增殖期，調(diào)整細胞濃度為3×104/mL。細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加100 μL 高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)24 h。隨后加入不同藥物處理，每組重復4次，設二甲基亞砜(DMSO)為實驗對照組。分別于0、24、48、72和96 h后，加入20 μL MTS，于孵箱放置2 h。在酶聯(lián)免疫檢測儀上讀取波長為490 nm處的吸光度值。實驗至少重復3次，結(jié)果取穩(wěn)定值。

1.5 流式細胞術檢測HeLa細胞的凋亡及病死率

HeLa細胞在相應藥物處理一定時間后，收集其上層培養(yǎng)液于離心管，冷PBS清洗2次，胰蛋白酶消化細胞并轉(zhuǎn)移至離心管，調(diào)整細胞濃度為1×106/mL。按照試劑盒說明書進行操作，使用流式細胞儀檢測。實驗至少重復3次，結(jié)果取穩(wěn)定值。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1UPR和ERAD通路中重要調(diào)控分子在宮頸癌組織中的表達

GRP78/BiP、IRE1α、P97和Ubiquitin定位在胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒狀，在宮頸癌組織中呈強陽性表達，而在正常宮頸鱗狀上皮組織中呈陰性表達。此外，在不同臨床分期(0、Ⅰ和Ⅱ期)的宮頸癌組織中，GRP78、IRE1α、p97和Ubiquitin的陽性表達情況存在一定的差異(圖1)。

2.2P97和IRE1α的小分子抑制劑對宮頸癌HeLa細胞增殖的抑制作用

不同濃度的P97抑制劑EerI以及IRE1α抑制劑4μ8C作用于宮頸癌HeLa細胞48 h，其增殖均受到明顯抑制(Plt;0.05)。并且，兩種抑制劑對HeLa細胞的生長抑制率隨著其作用濃度的升高而增加，呈劑量依賴性(圖2)。

A.elevated GRP78/BiP levels in cervical cancer；B.elevated P97 levels in cervical cancer；C.elevated Ubiquitin levels in cervical cancer；D.elevated IRE1α levels in cervical cancer

圖1宮頸癌組織和正常宮頸鱗狀上皮中GRP78/BiP、P97、Ubiquitin和IRE1α的陽性表達
Fig1ExpressionlevelofGRP78/BiP,P97,UbiquitinandIRE1αincervicalcancerandnormalcervicalepithelia(×400)

A.dose dependent effect of EerI on the viability of HeLa cells；B.dose dependent effect of 4μ8C on the viability of HeLa cells；*Plt;0.05 compared with control

圖2小分子抑制劑EerI和4μ8C對宮頸癌HeLa細胞增殖的抑制作用
Fig2ThegrowthinhibitionofEerIand4μ8CtoHeLacells

2.3P97和IRE1α的小分子抑制劑對宮頸癌HeLa細胞凋亡的誘導作用

不同濃度的P97抑制劑EerI和IRE1α抑制劑4μ8C分別處理HeLa細胞48 h，其中，細胞凋亡率隨EerI濃度的升高而增加，呈劑量依賴性。5 μmol/L和10 μmol/L的EerI可使細胞凋亡率分別達50%和80%以上(Plt;0.01)(圖3A)。32 μmol/L 4μ8C處理組的細胞凋亡率顯著增加，約達50%(Plt;0.05)(圖3B)。

2.4P97和IRE1α的小分子抑制劑影響宮頸癌HeLa細胞對抗癌藥物的敏感性

隨培養(yǎng)時間的增加，CDDP分別與2.5 μmol/L EerI和16 μmol/L 4μ8C聯(lián)用處理HeLa細胞，細胞存活率較CDDP、EerI和4μ8C單用處理組有明顯降低(Plt;0.05)，其中，4μ8C與CDDP聯(lián)用處理可使HeLa細胞存活率在48 h降低至20%(Plt;0.01)(圖4A，B)。此外，BTZ與2.5 μmol/L EerI和16 μmol/L 4μ8C聯(lián)用處理組的HeLa細胞存活率比BTZ、EerI和4μ8C單用處理組也有顯著降低(Plt;0.01)(圖4C，D)。值得注意的是，與CDDP相比，相同濃度的EerI和4μ8c更能提高HeLa細胞對BTZ的敏感性。

3 討論

UPR可以提高腫瘤細胞對周圍有害環(huán)境的適應能力，促進腫瘤的生長[9]。同時，抑制UPR信號通路的激活或者降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78/BiP的表達，可以有效阻礙腫瘤的生長[10-11]。因此，運用UPR信號通路分子(如IRE1α和GRP78/BiP)的抑制劑，或者阻礙ERAD通路的蛋白降解過程，將成為腫瘤治療的新靶點并為逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性提供新的思路。

A.dose dependent apoptosis-inducing effect of EerI on HeLa cells；B.dose dependent apoptosis-inducing effect of 4μ8C on HeLa cells；*Plt;0.05，**Plt;0.01 compared with control

圖3小分子抑制劑EerI和4μ8C對宮頸癌HeLa細胞凋亡的誘導作用
Fig3ApoptosisinducedbyEerIand4μ8CofHeLacells

A.EerI sensitized growth inhibition of HeLa cells by CDDP；B.4μ8C sensitized growth inhibition of HeLa cells by CDDP；C.EerI sensitized growth inhibition of HeLa cells by BTZ；D.4μ8C sensitized growth inhibition of HeLa cells by BTZ；*Plt;0.05，**Plt;0.01 compared with control

圖4小分子抑制劑EerI和4μ8C在不同程度上增強宮頸癌HeLa細胞對CDDP和BTZ的敏感性
Fig4EerIand4μ8CsensitizedHeLacellstoCDDPandBTZtodifferentextent

宮頸癌是全世界嚴重危害婦女健康的三大惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于乳腺癌。發(fā)展中國家是宮頸癌的高發(fā)區(qū)，發(fā)病率占全球?qū)m頸癌患者的85%，而病死率則位于婦科惡性腫瘤第二位[12]。

本研究首先發(fā)現(xiàn)，相對于正常宮頸鱗狀上皮細胞，IRE1α、P97、Ubiquitin和GRP78/BiP在不同分期宮頸癌癌巢部位表達水平均顯著升高，提示在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中伴隨了UPR和ERAD的發(fā)生，即ERS被激活。隨后檢測不同濃度P97的抑制劑EerI以及IRE1α的抑制劑4μ8C對HeLa細胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果顯示，小分子抑制劑EerI和4μ8C均呈劑量依賴的方式抑制HeLa細胞生長，同時伴隨有細胞的凋亡。

抗腫瘤藥物CDDP和BTZ均由于兩者的耐藥現(xiàn)象限制了其進一步廣泛應用。因此為檢測小分子抑制劑EerI和4μ8C對抗癌藥物BTZ和CDDP潛在的協(xié)同作用，本研究選擇一定濃度的EerI和4μ8C分別聯(lián)合BTZ和CDDP處理HeLa細胞48h，結(jié)果顯示，與單獨用藥處理相比，HeLa細胞生長抑制增強并且細胞凋亡率明顯上升。同時發(fā)現(xiàn)，與CDDP相比，4μ8C和EerI更能提高HeLa細胞對BTZ的敏感性。

綜上所述，對UPR和ERAD信號通路小分子抑制劑抗癌活性及其增強抗腫瘤藥物敏感性特性的揭示，將為抗癌藥物的研發(fā)提供新的靶點和方向。

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The combination of small-molecule inhibitors targeting the key proteins in theER stress response and anticancer drugs shows the inhibition effects to HeLa cells

NIE Meng1, LI Chuang1, YOU Yan2, CUI Quan-cai2, WANG Lin1*

(1.Dept. of Physiology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS amp; PUMC, Beijing 100050；2.Dept. of Pathology, PUMC Hospital, Beijing 100730, China)

ObjectiveTo investigate the therapeutic potential Eeyarestatin-Ⅰ (EerI) and 4μ8C, the small-molecule inhibitors of UPR signaling pathway in the cervical cancer.MethodsThe protein expression of GRP78/BiP, P97, Ubiquitin and IRE1α in normal cervical epithelia and cervical cancer were examined by immunohistochemistry. The effect of EerI and 4μ8C on HeLa cell proliferation and apoptosis were measured by MTS assay and flow cytometry, respectively. The combined antiproliferative effects of small-molecule inhibitors were carried out in combination of Bortezomib (BTZ) and Cisplatin (CDDP), respectively.ResultsGRP78/BiP, P97, Ubiquitin and IRE1α were significantly up-regulated in cervical cancer compared with normal cervical epithelia and displayed variability in the cervical cancer of different clinical stages (Plt;0.05). EerI and 4μ8C inhibited HeLa cell proliferation in a dose-dependent manner and induced HeLa cell apoptosis in a similar fashion (Plt;0.05).MTS assays in-dicated that combination treatment significantly enhanced the antiproliferative effect of single chemotherapy drugs (Plt;0.05).ConclusionsSmall-molecule inhibitors targeting at the key players of UPR show synergistic effects with other anticancer drugs suggesting a new therapeutic strategy towards cervical cancer.

endoplasmic reticulum stress; cervical cancer; small-molecule inhibitor; drug combination

2014-01-15

2014-03-13

國家自然科學基金(81372201)；中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所院所長啟動基金(2010RC01)

*通信作者(correspondingauthor)： lin.wang@ibms.pumc.edu.cn

1001-6325(2014)05-0638-06

R 33

A