付志豪，武 倫，喬正榮，周世驥，李生偉*

(重慶醫(yī)科大學 附屬第二醫(yī)院 1.肝膽外科； 2.胃腸外科， 重慶 400010；3.重慶市第五人民醫(yī)院 普外科， 重慶 400062)

研究論文

高強度聚焦超聲治療對肝癌細胞裸鼠移植瘤低氧誘導因子表達和細胞凋亡的影響

付志豪1，武 倫1，喬正榮3，周世驥2，李生偉1*

(重慶醫(yī)科大學 附屬第二醫(yī)院 1.肝膽外科； 2.胃腸外科， 重慶 400010；3.重慶市第五人民醫(yī)院 普外科， 重慶 400062)

目的探討高強度聚焦超聲(HIFU)治療后的殘余肝癌組織中低氧誘導因子(HIF-1α)、P53和凋亡的變化及關系。方法建立肝癌HpG2細胞系裸鼠移植瘤模型30只，采用CZF-Ⅱ型HIFU治療儀治療,隨機分為對照組、治療后1、3及5 d和1及2周組。HE染色觀察標本病理變化；TUNEL法檢測殘余癌組織凋亡及計算凋亡指數；免疫組化、Western blot和實時熒光定量 PCR技術檢測HIF-1α、P53蛋白和mRNA水平。結果治療后有殘余腫瘤細胞和大片壞死區(qū)域。與其他組相比，凋亡指數在3 d組顯著升高(Plt;0.05)，在5 d、1和2周組逐漸下降。HIF-1α和P53蛋白在各組中出現強弱不同的表達。HIF-1α和P53蛋白和mRNA在治療后1～3 d表達逐漸升高，在3 d組顯著高于其他組(Plt;0.05)，在5 d、1和2周組逐漸下降。結論HIFU治療肝癌細胞裸鼠移植瘤后可以促進殘余癌細胞凋亡，此可能與HIF-1α、P53基因表達異常關系密切。

肝癌;低氧誘導因子;凋亡;高強度聚焦超聲

肝癌(hepatocellular carcinoma)是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，手術切除一直是首要的治療手段。但由于肝癌的早期癥狀與體征不明確，致使大多患者在確診時就已錯過最佳手術治療時機。高強度聚焦超聲(high-intensity focused ultrasoun-d,HIFU)是一種對實體腫瘤進行非侵入性治療的局部治療手段[1]，為中晚期肝癌的治療提供了契機。但是HIFU治療后殘余腫瘤組織是影響療效的主要因素。研究發(fā)現，HIFU治療對腫瘤的微血管產生損害，導致殘余癌組織微環(huán)境低氧[2]。低氧會誘導機體產生一系列因子，其中最重要的是HIF-1α。同時低氧也可以誘導的P53表達增多，而P53是細胞凋亡最主要因子之一[3]。本研究通過建立人肝癌裸鼠移植模型，觀察HIFU治療后殘余癌組織中細胞凋亡與HIF-1α、P53的表達情況。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

清潔級，裸鼠30只，6 ～8周齡，雌雄不限，體質量18 ～20 g[重慶醫(yī)科大學動物實驗中心，合格證號SCXK(渝)2012-0001 ]，混合飼料，隔籠喂養(yǎng)。

鼠抗人單克隆抗體HIF-1α、P53(Abcam公司)，TUNEL試劑盒(Roche公司)，免疫組化試劑盒(中衫金橋公司)，RT reagent Kit(Takara公司)，RNA抽提試劑盒(Omega公司)，反轉錄試劑盒(Takara公司)。

1.3 方法

1.3.1 裸鼠肝癌移植瘤模型的建立、分組及治療方式：30只裸鼠, 用0.25%胰蛋白酶消化呈單個的人肝癌細胞HpG2(由重慶醫(yī)科大學生命科學院實驗室惠贈)細胞，調整細胞數至1×107/mL，在裸鼠右側前頸部皮下接種細胞懸液0.1 mL。待裸鼠皮下移植瘤直徑約0.5 ～1.0c m時，使用CZF-Ⅱ型超聲治療儀，輸入治療參數(探頭頻率8.6 MHz，脈沖1 000 Hz，功率5 W)，治療時間為30 s。非治療組不給于任何處理。對照組、HIFU治療后1、3及5 d和1及2周各取5只裸鼠頸椎脫臼法處死，收集標本。

1.3.2 HE染色觀察各組腫瘤組織的病理變化：處死裸鼠后，標本使用4%多聚甲醛固定24 h后，給予常規(guī)脫水，透明浸蠟和包埋。石蠟切片，厚約4 μm，每組標本取5片HE染色，光鏡下觀察。

1.3.3 缺口末端核苷標記法(TUNEL)檢測凋亡及計算凋亡指數：取出各組標本，具體步驟按TUNEL試劑盒說明書進行。陽性標準:顯微鏡下腫瘤細胞系顯色棕黃色顆粒為陽性，每組隨機取5個高倍視野(×400)，計算凋亡指數(AI)=陽性細胞數/腫瘤細胞數×100%。

1.3.4 免疫組化檢測各組腫瘤組織中的HIF-1α和P53蛋白變化：取出各組標本，采用免疫組化SP法檢測各組HIF-1α、P53蛋白表達情況。具體步驟按照免疫組化試劑盒說明書進行。陽性標準：在顯微鏡下，胞質或胞核出現棕黃色為陽性。

1.3.5 Western blot 檢測各組腫瘤組織中的HIF-1α和P53蛋白含量：取出各組標本，提取組織蛋白、制備SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳、轉膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗、洗滌等過程，然后顯影，分析結果。

1.3.6 實時熒光定量PCR法檢測各組基因HIF-1αmRNA和P53 mRNA的表達。將組織磨碎，提取無RNase的水溶解RNA，RNA定量。反轉錄參照試劑盒，熒光定量聚合酶鏈反應擴增條件為95 ℃預變性2 min；隨后95 ℃ 10 s，退火溫度15 s，72 ℃ 延伸45 s，共40個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。上游引物5′-AAACCTAAATGTTCTGCCTAC-3′，下游引物5′-GGATGTTAATAGCGACAAAGT-3′。P53:上游引物5′-CCTCCTCAGCATCTTATCCG-3′，下游引物 5′-TGGTACAGTCAGAGCCAACCT-3′。采用ΔΔCT法進行實時定量PCR相對定量反應，計算相對含量。

（1）讓學生改變角色，想象自己是孟母。（2）小組討論：孟母在這樣的環(huán)境，看到孟子的表現，她有什么感受？有何打算？

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 移植瘤HIFU治療后的肉眼改變。

與對照組相比，1 d組標本的消融區(qū)域可見到成灰白色的凝固性壞死，周圍存在殘余腫瘤組織。在消融后3及5 d和1及2周組的標本可見靶向區(qū)存在陳舊性壞死 (圖1)。

2.2 光鏡下HIFU治療后移植瘤的病理變化

與對照組相比,在1 d組的消融區(qū)出現大量壞死，在空白區(qū)域之間有殘留腫瘤細胞。在3 d組的消融靶區(qū)邊緣可見少量小血管和正常的腫瘤細胞，同時纖維組織增生，逐漸將壞死區(qū)域包裹。在5 d和1及2周組中殘余腫瘤細胞也在逐漸增生(圖2)。

2.3 在光鏡下TUNEL檢測殘余腫瘤的凋亡結果

在各組觀察的細胞凋亡，可見細胞系呈棕黃色顆粒的凋亡細胞(圖3)。與對照組相比，在1 d組凋亡指數出現升高(Plt;0.05)。在3 d組達到高峰，在5 d和1及2周組凋亡指數呈現下降趨勢(圖4)。

2.4免疫組化檢測HIF-1α、P53蛋白在各組的表達

在顯微鏡下，HIF-1α蛋白的表達定位于腫瘤細胞胞質，P53蛋白的表達定位于細胞系出現棕黃色顆粒。在對照組，可見胞質或胞核染色淺，數量也較少。消融后胞質或胞核染色逐漸加深，而且數量也逐漸增加(圖5)。

A.control group；B.1 day group圖1 HIFU治療后的移植瘤變化Fig 1 The changes of xenograft after treatment by HIFU

A.contol group；B.1 day group；C.1 week group圖2 不同組腫瘤的形態(tài)學改變Fig 2 Changes of morphology on tumorous tissues in different groups(HE ×200)

*Plt;0.05 compared with control group；#Plt;0.05 compared with other groups圖4 凋亡指數在各組情況Fig 4 Apoptosis index in different groups

2.5Westernblot檢測HIF-1α和P53蛋白在各組的表達

治療后HIF-1α和P53蛋白表達逐漸升高，在3 d組達到高峰(Plt;0.05)。在5 d和1及2周組HIF-1α和P53蛋白的表達呈現逐漸下降(圖6)。

2.6實時熒光定量PCR技術檢測HIF-1α、P53mRNA水平

治療后HIF-1α和P53 mRNA水平逐漸升高，在3 d組達到高峰(Plt;0.01)。在5 d和1及2周組HIF-1α和P53 mRNA的表達呈現逐漸下降(圖7)。

3 討論

HIFU是中晚期癌癥的一種安全易行的局部非侵入治療方法[4]，已在部分良惡腫瘤中廣泛應用[5]，但在肝癌治療時由于肋骨遮擋、熱沉積效應、呼吸運動和定位方式存在治療盲區(qū)等因素，引起殘癌細胞的存在，而后者正成為影響HIFU治療肝癌效果的關鍵環(huán)節(jié)[6]。因此，弄清殘癌細胞的凋亡規(guī)律可能為盡可能的殺傷殘癌組織、提高HIFU治療效果而備受關注。本實驗結果顯示HIFU治療肝癌細胞裸鼠移植瘤后，第1天腫瘤細胞凋亡指數顯著增加，3 d時達到高峰，隨后下降，2周時凋亡指數回到基線水平。此與HIFU消融兔肝后消融區(qū)域周圍出現的細胞凋亡變化規(guī)律相一致[7]。由此可見HIFU治療肝癌細胞裸鼠移植瘤后可以促進殘余癌細胞凋亡，其效應的時間窗為2周。

本實驗通過檢測HIFU治療后殘余腫瘤組織中HIF-1α表達情況，發(fā)現其在治療后1 d顯著升高，在3 d時達到高峰，隨后下降。研究表明HIFU治療腫瘤時可以對腫瘤的微細血管造成嚴重損傷，從而導致殘余腫瘤組織的微環(huán)境低氧[2]。低氧可以引起HIF-1α的表達和聚集，它通過促進紅細胞生成，血管形成，核苷、氨基酸、糖的能量代謝，細胞存活，凋亡等生物學效應使機體、 組織、細胞適應低氧環(huán)境[8-9]。此可能部分解釋了HIFU治療早期殘癌細胞中HIF-1α表達上調。而另一方面已證實HIF-1α主要在氧濃度0%～2%之間穩(wěn)定聚集[10]，隨著消融時間的延長，血管新生和單個殘癌細胞微環(huán)境氧含量的增多，HIF-1α會被迅速降解。本實驗亦觀察到HIF-1α表達達峰后隨著HIFU治療時間延長表達下調，同時還發(fā)現HIF-1α表達與殘癌細胞凋亡指數變化的時間點規(guī)律一致。關于HIFU治療后HIF-1α與殘癌細胞凋亡的機制尚不清楚，既往研究表明P53在低氧微環(huán)境時表達，而表達穩(wěn)定性與HIF-1α相關[11～12]。HIF-1α可以通過與MDM2結合，促進P53基因的穩(wěn)定從而促進低氧區(qū)域細胞凋亡[13]。因此本研究進一步觀察了P53在殘余腫瘤組織中表達情況，結果發(fā)現P53與HIF-1α和凋亡指數出現顯著升高的時間點基本一致。推測HIFU治療引起肝癌細胞裸鼠移植瘤的殘癌細胞凋亡作用可能與HIF-1α、P53基因表達異常關系密切，確切的信號通路機制本實驗課題組正在探討中?？傊?，HIFU治療肝癌細胞裸鼠移植瘤后可誘導殘余癌細胞凋亡，此效應可能與HIF-1α、P53基因表達異常關系密切;調控HIF-1α基因的表達有望成為HIFU治療后殘余癌組織靶向殺傷作用的潛在靶點，這為增強HIFU治療效果提供了新方法。

A.control group(weak) ； B.1 day group(moderate) ；C.3 days group(strong); D.control group (weak) ； E.1 day group(moderate) ；F.3 days group(strong)

圖5免疫組化檢測HIF-1α、P53蛋白表達的情況
Fig5ExpressionofHIF-1α,P53intumoroustissuesofdifferentgroups(Immunohistochemistry×400)

*Plt;0.05 compared with control group； #Plt;0.05 compared with other groups圖6 HIF-1α和P53蛋白在各組腫瘤組織中的表達Fig 6 Expression of HIF-1α,P53 in tumorous tissues of different groups detected by Western blot(±s,n=5)

*Plt;0.05 compared with control group； #Plt;0.01 compared with other groups圖7 實時熒光定量 PCR檢測HIF-1α、P53 mRNA在各組中的表達

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Effect of HIFU on hypoxia-inducible factor (HIF-1α)expression and cell apoptosis in liver cancer cell xenografts of nude mice

FU Zhi-hao1, WU Lun1, QIAO Zheng-rong3, ZHOU Shi-ji2, LI Sheng-wei1*

(1.Dept. of Hepatobiliary Surgery; 2.Dept. of General Surgery, the Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical UniversityChongqing 400010; 3.Dept. of General Surgery,People’s Five Hospital of Chongqing,Chongqing 400062,China)

ObjectiveTo study the effects of hypoxia-inducible factor (HIF-1α) on apoptosis of the residual tumor cells in nude mice after treatment by high-intensity focused ultrasound (HIFU).MethodsHuman HCC implantation was established in 30 nude mice. CZF-Ⅱ HIFU therapeutic apparatus was used for treatment.Nude mice were randomly divided into control group and treatment group (included 1 d group, 3 d group, 5 d group, 1 week group,and 2 weeks group). Pathological changes were observed with HE staining;Cell apoptosis was detected by DNA agarose gel electrophoresis and terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated Dutp nick end-labeling (TUNEL) assay; SP immunohistochemistry was used to detect HIF-1α protein;Western blot and real-time quantitative PCR were used to detect HIF-1α, P53 protein and mRNA expression levels.ResultsHE showed that there were residual tumor cells and large necrotic areas after treatment. Compared with other groups, the apoptosis index

in 3 d group was significantly higher (Plt;0.05), while in the 5 d group,1 week group,2 weeks group gradually decreased. Immunohistochemistry showed that the expression of HIF-1α, P53 protein was different in each group. Compared with other groups,Western blot and RT-PCR showed an increase of HIF-1α, P53 protein and mRNA levels in groups after treatment of 1 to 3 days, and peaked in 3 d group(Plt;0.05).ConclusionsHIFU treatment can induce consistent apoptosis in residual tumor, which may be related with disordered expression of HIF-1α and P53.

liver neoplasms; hypoxia-inducible factor; apoptosis; high-intensity focused ultrasound

2013-06-21

2014-03-22

國家自然科學基金 (81301975,81272570);重慶市衛(wèi)生局重點資助項目(渝衛(wèi)2012-1-040,渝衛(wèi)2010-1-68)

*通信作者(correspondingauthor)：lswgg@126.com

1001-6325(2014)05-0648-06

R 735.7

A