于艷囡，王海萍，呂 洋

(河北北方學(xué)院 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室, 河北 張家口 075000)

bFGF體外誘導(dǎo)大鼠BMSCs分化為心肌樣細(xì)胞

于艷囡，王海萍*，呂 洋

(河北北方學(xué)院 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室, 河北 張家口 075000)

心血管病嚴(yán)重危害人類健康，各種因素作用于心肌細(xì)胞均可引起不可逆性損傷，干細(xì)胞培養(yǎng)有望從根本上治療這一疾病。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)具有強(qiáng)大增殖和分化能力，BMSCs在不同的誘導(dǎo)劑作用下可以向骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞等分化[1]。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)具有激活心肌細(xì)胞增生的潛能,bFGF促進(jìn)細(xì)胞增生的作用與其濃度有一定關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)旨在用不同濃度bFGF對(duì)大鼠BMSCs進(jìn)行體外誘導(dǎo)，并探究其有效性，尋找最適濃度。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和試劑:SPF級(jí)3周SD大鼠(20～30 g)，雌雄均可(河北醫(yī)科大學(xué) 合格證號(hào)：908134)。IMDM培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(蘭州民海公司)，α-actin，desmin(北京博奧森公司)， cTnT(NeoMark公司)，免疫細(xì)胞化學(xué)染色試劑盒(北京四正柏公司)。

1.2 方法

1.2.1 分離BMSCs純化擴(kuò)增培養(yǎng)：取大鼠四肢長(zhǎng)骨，沖出骨髓液過濾接種于培養(yǎng)瓶，調(diào)整細(xì)胞于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后換液，此后每3天換液1次，貼壁細(xì)胞達(dá)90%匯合時(shí)消化，接種傳代。第2代培養(yǎng)48 h后，A、 B和C組分別加0.5、 1和2 ng/mL bFGF，D組空白對(duì)照。誘導(dǎo)3 d后去除誘導(dǎo)，普通培養(yǎng)基培養(yǎng)4周。

1.2.2 心肌標(biāo)志鑒定：培養(yǎng)的細(xì)胞PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，再洗3次，山羊血清封閉1 h，分別加入 α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白(α-actin)、結(jié)蛋白desmin和心肌肌鈣蛋白T(cTnT)，4 ℃孵育過夜，加PBS作空白對(duì)照，其他步驟按試劑盒說明，最后蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，中性樹脂固定,顯微鏡下觀察。

1.2.3 免疫熒光檢測(cè)：取培養(yǎng)的B組細(xì)胞爬片，然后按試劑盒說明書操作，激光掃描共焦顯微鏡下觀察。另將第1個(gè)一抗換成cTnT，其余步驟同上。

1.2.4 透射電鏡觀察：培養(yǎng)的B組細(xì)胞消化，PBS懸浮，90×g離心，洗3次，2 100×g離心，細(xì)胞團(tuán)置戊二醛(2.5%)40 ℃固定，PBS沖洗，1%鋨酸固定30 min，PBS沖洗，逐級(jí)丙酮脫水，包埋，切片，透射電鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:應(yīng)用SPSS分析資料，免疫細(xì)胞化學(xué)各指標(biāo)陽(yáng)性率比較用卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的培養(yǎng):誘導(dǎo)培養(yǎng)后B組細(xì)胞呈短柱狀，相鄰細(xì)胞緊密接觸，A、C組不明顯，D組為成纖維細(xì)胞樣(圖1)。

A.BMSCs were cultured for 28 days in group D;B.BMSCs were cultured for 28 days in group B圖1 倒置相差顯微鏡觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Fig 1 The cultured cells observed under phase contrast microscope(×200)

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定: 誘導(dǎo)細(xì)胞可見 α-actin、desmin及cTnT陽(yáng)性，D組為陰性。B組細(xì)胞中α-actin、desmin和cTnT陽(yáng)性率最高，分別為 58.73%、34.14%和25.34%；A組分別為46.71%、28.52%和17.25%；C組為 47.65%、29.15% 和16.31%(圖2)。

2.3 熒光免疫化學(xué)鑒定:B組中培養(yǎng)細(xì)胞,胞質(zhì)內(nèi)α-actin的表達(dá)呈紅色，cTnT的表達(dá)呈綠色，兩者同時(shí)觀察時(shí)重疊的部分呈黃色(圖3)。

2.4 透射電鏡觀察:透射電鏡下觀察B組中分化細(xì)胞呈分支桿狀，核橢圓，胞質(zhì)內(nèi)有平行排列的肌絲、核糖體和線粒體等，總體呈類心肌細(xì)胞樣(圖4)。

3 討論

bFGF為體內(nèi)細(xì)胞因子，能夠?qū)崿F(xiàn)中胚層細(xì)胞的快速增殖和分化，低濃度的bFGF對(duì)分化有促進(jìn)作用[2]，所以對(duì)bFGF在低濃度進(jìn)行限定，結(jié)果B組中28 d即形成類心肌細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)，而對(duì)照組為成纖維細(xì)胞樣，說明bFGF可誘導(dǎo)BMSCs分化為心肌樣細(xì)胞。

α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白能夠特異性地識(shí)別骨骼肌和心肌，結(jié)蛋白是心肌特異性的中間纖維蛋白[3]，心肌肌鈣蛋白T具有較高的心肌特異性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果中α-actin、desmin、cTnT的陽(yáng)性率值及比較說明， BMSCs可被誘導(dǎo)成肌源性細(xì)胞，其中包括骨骼肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞,培養(yǎng)濃度1 ng/mL較合適。

A.the expression of α-actin after 4 weeks induction in group B; B.the expression of desmin after 4 weeks induction in group B; C.the expression of cTnT after 4 weeks induction in group B; D.the expression of α-actin after the same time in group D; E.the expression of desmin after the same time in group D; F.the expression of cTnT after the same time in group D

圖2BMSCs的免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果
Fig2ImmunohistochemicalstainingofBMSCs(×400)

A.red light was signed to α-actin; B.green light was signed to cTnT; C.they were both been showed,it changed to yellow圖3 免疫熒光化學(xué)鑒定結(jié)果Fig 3 Results of laser scanning confocal microscopy(×400)

A.B.a lot of glycogen,ribosome and paralled myofilament were founded in plasm圖4 透射電鏡觀察結(jié)果Fig 4 Results of tranmission electron microscope

對(duì)分化率較高的B組免疫熒光檢測(cè)和透射電鏡觀察，證實(shí)了誘導(dǎo)的有效性。

綜上所述，bFGF能在體外誘導(dǎo)BMSCs分化為心肌細(xì)胞，且1 ng/mL可能是最適誘導(dǎo)濃度。

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2013- 11- 28

河北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(ZH2012001)；河北北方學(xué)院創(chuàng)新人才培育基金(CXRC1315)；河北北方學(xué)院青年基金(Q2013027)

*通信作者(correspondingauthor)： haipingmimi@126.com

1001-6325(2014)08-1101-03

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