王音WANG Yin；沈勇猛SHEN Yong-meng；侯冠華HOU Guan-hua

（①中國(guó)檢驗(yàn)認(rèn)證集團(tuán)寧波有限公司，寧波 315000；②浙江工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧波 315000）

（①China Certification &Inspection Group Ningbo Co.，Ltd.，Ningbo 315000，China；②Zhejiang Business Technology Institute，Ningbo 315000，China）

0 引言

我國(guó)作為世界竹子的分布中心和起源地之一，竹子資源占世界總量的30%[1]。每年3-4月份，我國(guó)竹子主產(chǎn)區(qū)會(huì)出產(chǎn)大量的竹筍。這些竹筍只有一部分用于鮮食，由于竹筍不易保鮮，所以大多數(shù)的竹筍通常是被加工成筍干或罐頭。在竹筍的加工過(guò)程中，實(shí)際可食用的筍肉大概只占整個(gè)筍體的30%[2]，不可食用的筍頭和筍殼則成為了加工的廢棄物。以往這些廢棄物只是被簡(jiǎn)單丟棄，腐爛霉變之后對(duì)環(huán)境造成了負(fù)面影響，而且極大地浪費(fèi)了寶貴的生物資源。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)筍殼加工廢棄物的再利用有多種開(kāi)發(fā)途徑，主要都是通過(guò)微生物發(fā)酵的手段，將筍殼用于制備膳食纖維、有機(jī)肥和生產(chǎn)動(dòng)物飼料[3]。利用筍殼生產(chǎn)動(dòng)物飼料主要是將筍殼處理后接入纖維素分解菌和蛋白質(zhì)分解菌[4]等，通過(guò)微生物的代謝活動(dòng)，利用筍殼中富含的纖維素和礦物質(zhì)等微量元素，有效轉(zhuǎn)化分解抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)，從而達(dá)到提高蛋白含量，改善筍殼的適口性的目的，制成的飼料原料養(yǎng)分更高且無(wú)毒害作用，從口感上來(lái)看也更能被牲畜采食、消化和吸收[5]。不僅有效消除了廢棄筍殼對(duì)環(huán)境的影響，而且提高了生物資源利用率，有效緩解人畜共糧的矛盾[6]。目前發(fā)酵筍殼生產(chǎn)動(dòng)物飼料的研究者一般只采用2-3 個(gè)菌種用于實(shí)驗(yàn)[7]。本研究中使用了霉菌、芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌，探索多菌種發(fā)酵的筍殼處理方式，以求達(dá)到更好更有效的發(fā)酵效果。通過(guò)對(duì)菌株混合比例、錯(cuò)時(shí)發(fā)酵方式等的優(yōu)化，尋找有效發(fā)酵筍殼制備生物飼料的新工藝。

1 材料

1.1 菌種 自行篩選得到的具有纖維素分解能力的霉菌菌株N2 和N8，芽孢桿菌（BX2）、酵母菌（H7）和乳酸菌（G16）均由寧波大學(xué)食品微生物研究室保存提供。

1.2 培養(yǎng)基 芽孢桿菌BX2 采用LB 固體培養(yǎng)基：1%蛋白胨，1% NaCl，0.5%酵母浸膏，1.5%瓊脂，加蒸餾水溶解，調(diào)節(jié)pH 值至7.0，121℃高壓蒸汽滅菌20min。N2 與N8采用PDA 斜面培養(yǎng)基[8]：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15-20g，自來(lái)水1000mL，自然pH，121℃高壓蒸汽滅菌20min。酵母菌H7 采用麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基[9]：將干麥芽磨碎，加入3.5 倍量的65℃溫?zé)崴?.5-4Kg，于58-60℃保溫糖化3-4h，用碘液檢查糖化完全后，將其煮沸，瓊脂10-15%。乳酸菌G16 采用乳酸菌分離培養(yǎng)基[10]：水100ml、牛肉膏1g、蛋白胨1g、酵母膏1g、番茄汁20g、葡萄糖1g、吐溫0.05ml、碳酸鈣1.7g、溴甲酚綠0.01g、瓊脂1-2g。PDA液體培養(yǎng)基[11]：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，自來(lái)水1000mL，自然pH，121℃高壓蒸汽滅菌20min。固體發(fā)酵培養(yǎng)基：筍殼粉90%，麩皮8%，（NH4）2SO42%，含水量65%，自然pH。

2 試驗(yàn)方法

2.1 菌株兼容性實(shí)驗(yàn) 按照表1 的設(shè)計(jì)，從五個(gè)菌株（N2、N8、BX2、H7 和G16）中每次取三個(gè)，呈三角狀點(diǎn)植于PDA 平板上（分組方案見(jiàn)表1），經(jīng)過(guò)4d 培養(yǎng)，觀察各菌株的生長(zhǎng)情況以及互相之間的影響。

若相鄰兩菌株均能正常生長(zhǎng)，兩個(gè)菌落交接處自然融合，則判定為兩菌種能相容；若相鄰兩菌株起初長(zhǎng)勢(shì)基本相當(dāng)，后其中一菌落出現(xiàn)生長(zhǎng)減慢的情況，菌落交接處略有間隙，則判定為兩菌種部分相容；若兩菌株間存在相當(dāng)明顯的生長(zhǎng)趨勢(shì)的差別，其中一菌落被另一菌落包圍且相接處有明顯分割線，則判定為兩菌種不能相容。

2.2 液體種子的制備 按照1.2 分別接種五個(gè)備選菌株，28℃培養(yǎng)活化，待觀察發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生孢子成熟后用無(wú)菌生理鹽水將孢子洗下，并稀釋成濃度為107個(gè)/mL 的孢子懸液。將5mL 孢子懸液接入裝有70mLPDA 液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃搖床培養(yǎng)1d。

2.3 菌株接入方式

2.3.1 N2、N8 和BX2 混合比例 將N2、N8 和BX2 的液體種子分別按不同的比例混合，按10%的接種量將混合后的液體種子接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于恒溫箱中以37℃條件下培養(yǎng)72h。發(fā)酵結(jié)束后分別測(cè)量產(chǎn)物中粗蛋白含量和CMC 酶活，選擇粗蛋白含量和酶活都較高的配比為最佳的菌株配比。

2.3.2 G16 和H7 的錯(cuò)時(shí)接入方式 利用2.3.1 試驗(yàn)所篩選出來(lái)的最佳菌株配比在固體發(fā)酵培養(yǎng)基中接入混合液體種子，于恒溫箱中以37℃下培養(yǎng)，然后按照表2 設(shè)計(jì)的方案，以不同的方式接入G16 和H7 的液體種子，72h 發(fā)酵結(jié)束。

以未接入G16 和H7 的固體培養(yǎng)基為對(duì)照，分別測(cè)量發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量和CMC 酶活，選擇粗蛋白含量和酶活都較高的接入方式為最佳的錯(cuò)時(shí)接入方式。

表2 G16 和H7 錯(cuò)時(shí)接入方式實(shí)驗(yàn)組

2.4 粗蛋白含量測(cè)定

運(yùn)用凱氏定氮法，測(cè)定粗蛋白含量。

2.5 CMC 酶活測(cè)定 取1.5ml 0.05 mol/L 醋酸緩沖液配制的1.0%羧甲基纖維素鈉溶液，加入0.2ml 粗酶液，50℃反應(yīng)20min，用DNS 法測(cè)定反應(yīng)后還原糖（葡萄糖）含量，同時(shí)做空白對(duì)照扣除本底。酶活定義[12]為上述條件下，1ml 發(fā)酵液1min 催化底物生成1μmol 葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活力單位“U”。

2.6 發(fā)酵效果評(píng)價(jià) 對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品的氣味、色澤和質(zhì)地進(jìn)行觀察。由于發(fā)酵產(chǎn)物的氣味最能直接反應(yīng)發(fā)酵效果，而色澤和質(zhì)地也能同時(shí)從不同的感官角度評(píng)價(jià)發(fā)酵的成敗，因此設(shè)計(jì)表3 評(píng)價(jià)筍殼粉的發(fā)酵效果。

3 結(jié)果與分析

3.1 兼容性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照表1 的設(shè)計(jì)將五個(gè)菌株分組培養(yǎng)后，通過(guò)觀察各菌株的生長(zhǎng)情況以及互相之間的影響后，對(duì)各菌株之間的兼容性作出評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表4。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)個(gè)別菌株兩兩共生時(shí)，存在其中一個(gè)菌株生長(zhǎng)較緩慢，菌落之間相接觸部分較小的情況。而大多數(shù)菌株兩兩之間都能夠良好生長(zhǎng)，兩個(gè)菌落相交處接觸緊密。總體而言，這五個(gè)菌株之間都均沒(méi)有強(qiáng)的拮抗作用，在一起能共存，呈現(xiàn)出較好的兼容性。因此，五個(gè)菌株都可以用于在同一個(gè)發(fā)酵體系內(nèi)生長(zhǎng)。

3.2 混菌接入方式試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 N2、N8 和BX2 的最佳混合比例 將N2、N8 和BX2 按照不同比例混合，按照10%的接種量接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37℃條件下培養(yǎng)72h 后，測(cè)量產(chǎn)物中粗蛋白含量和CMC 酶活，測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表5。

表3 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表4 菌株兼容性評(píng)價(jià)結(jié)果

通過(guò)對(duì)比表5 中粗蛋白的含量和CMC 酶活，可以得到以下結(jié)論：N2 和N8 混菌發(fā)酵產(chǎn)生了疊加效應(yīng)，推測(cè)是這兩個(gè)菌株分別產(chǎn)生不同種類的纖維素分解酶，共同作用的時(shí)候產(chǎn)生了功能互補(bǔ)，從而達(dá)到了更好的發(fā)酵效果。N2，N8 和BX2 以3:2:1 的比例接入固體培養(yǎng)基后共同發(fā)酵，三個(gè)菌株之間發(fā)揮了最佳的協(xié)同作用，CMC 酶活達(dá)到最高值26.4U/mL，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量最高，為20.33%，比空白組中粗蛋白含量提高了57.8%，是最適合的菌種混合比例。

表5 三菌種混合發(fā)酵效果

3.2.2 H7 和G16 的最佳錯(cuò)時(shí)接入方式 將N2、N8 和BX2 按照3:2:1 的比例接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵一定時(shí)間后按照表2 的設(shè)計(jì)，以不同方式接入菌種H7 和G16，72h 發(fā)酵結(jié)束后測(cè)量發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量和CMC酶活，測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表6。

根據(jù)表6 顯示的數(shù)據(jù)可見(jiàn)，按照實(shí)驗(yàn)組F（將纖維素分解菌N2、N8 和芽孢桿菌BX2 以3:2:1 的比例接入固體培養(yǎng)基發(fā)酵24h 后同時(shí)接入2%的乳酸菌G16 和2%的酵母菌H7）的設(shè)計(jì)進(jìn)行發(fā)酵，72h 后得到的發(fā)酵效果最佳。發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量為24.36%，比對(duì)比組A 組的粗蛋白含量提高了19.8%。CMC 酶活提高到30.2U/mL，比A 組提高了14.4%。

3.2.3 發(fā)酵效果評(píng)價(jià) 觀察發(fā)酵結(jié)束后產(chǎn)品的氣味、色澤和質(zhì)地，結(jié)合表3 的評(píng)價(jià)方式，感官評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表7。由表7 所示感官表現(xiàn)，產(chǎn)品的感官評(píng)價(jià)結(jié)果分值為8 分。說(shuō)明按照如上的發(fā)酵方法處理筍殼粉，發(fā)酵出來(lái)的產(chǎn)品作為飼料，其外觀量好，適口性強(qiáng)。

表6 五菌種混合發(fā)酵效果

表7 筍殼發(fā)酵后感官評(píng)價(jià)結(jié)果

4 結(jié)論

通過(guò)以上固體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)N2，N8 和芽孢桿菌BX2 以3:2:1 的比例接種在固體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵24h 后同時(shí)接入2%的乳酸菌G16 和2%的酵母菌H7，各菌種之間達(dá)到最佳的共生和營(yíng)養(yǎng)作用，產(chǎn)生了最大量的纖維素分解酶，CMC 酶活達(dá)到30.2U/mL，有效提高了固體培養(yǎng)基中粗蛋白的含量，使粗蛋白含量提高到24.36%，且發(fā)酵產(chǎn)品的外觀良好，是最佳的混菌配比和接入方式。

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