李紅英，陳紅霞，汪 蕾

(1.湖北省婦幼保健院，湖北 武漢430070;2.湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 咸寧437100;3.湖北中醫(yī)藥大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，湖北武漢430065)

對(duì)已形成的腫瘤而言，腫瘤微環(huán)境缺乏有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答［1］。近年研究發(fā)現(xiàn)，部分促凋亡的藥物不僅能直接損傷腫瘤細(xì)胞，還能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞在膜表面暴露鈣網(wǎng)織蛋白等免疫原性相關(guān)分子，促進(jìn)樹突狀細(xì)胞(DC)成熟，從而活化腫瘤抗原特異性T細(xì)胞［2］，重建腫瘤微環(huán)境中特異性的抗腫瘤免疫。卡鉑是治療卵巢癌的一線用藥，雖然能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但無(wú)法誘導(dǎo)免疫原性分子的表達(dá)［3］。因此尋找其他能激活腫瘤免疫原性的藥物有助于抗腫瘤免疫。紫草素是傳統(tǒng)中藥提取物，具有誘導(dǎo)凋亡等多種生物學(xué)活性［4］。但是能否增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞的免疫原性有待研究。本研究通過(guò)紫草素誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡，觀察凋亡癌細(xì)胞上調(diào)DC表達(dá)成熟相關(guān)膜分子CD86的作用及其與癌細(xì)胞膜表面鈣網(wǎng)織蛋白(CRT)的關(guān)系，為臨床上建立化療誘導(dǎo)的卵巢癌免疫治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1 試劑和細(xì)胞系 人卵巢癌HO-8910細(xì)胞系由湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院凍存。紫草素(S7576，純度≥98%)購(gòu)自Sigma公司，1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FCS)購(gòu)自Gibco公司。人淋巴細(xì)胞分離液Ficoll(C1077)購(gòu)自北京普利萊有限公司。PE標(biāo)記的抗人CRT流式抗體(83220)購(gòu)自美國(guó) Abcam公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗人 CD1α流式抗體(300104)、PE標(biāo)記的抗人CD86流式抗體(305406)、rhGMCSF(572902)和rhlL-4(574002)均購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司，凋亡檢測(cè)試劑盒(AnnexinⅤ-FITC/PI，KGA107)購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。鈣網(wǎng)織蛋白抑制性多肽(CRT inhibitor，3077BP-50)購(gòu)自美國(guó) Biovision公司。

1.2 儀器 流式細(xì)胞儀(BD LSR-Ⅱ，美國(guó)BD公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 卵巢癌HO-8910細(xì)胞培養(yǎng)以及紫草素處理細(xì)胞在37℃含5%CO2的空氣培養(yǎng)箱，卵巢癌HO-8910細(xì)胞加入含10%FCS的1640，取處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化洗滌后以1×109L-1的密度接種于6孔板，每孔加入DMEM完全培養(yǎng)基3 mL。實(shí)驗(yàn)分為不同濃度(1 μmol/L、2.5 μmol/L以及5 μmol/L)紫草素處理組和未加入紫草素的對(duì)照組。紫草素用DMSO溶解后用培養(yǎng)基稀釋至終濃度，DMSO的終濃度為0.1%;對(duì)照組培養(yǎng)基中含有0.1%DMSO。48 h消化收集細(xì)胞以300 g離心5 min，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集1.3.1中各組HO-8910細(xì)胞用PBS洗2遍，將細(xì)胞以5×108L-1的濃度重懸500 μL 的 Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，加入 10 μL Annexin VFITC和5 μL Propidium Iodide混勻，室溫下避光反應(yīng)15 min，隨后應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Annexin V單陽(yáng)性細(xì)胞占所有細(xì)胞的比例即為凋亡率。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞膜表面鈣網(wǎng)織蛋白的表達(dá) 收集1.3.1中各組HO-8910細(xì)胞用 PBS洗2遍，取5×108L-1細(xì)胞重懸于200 μL的PBS中，加入20 μL PE標(biāo)記的鈣網(wǎng)織蛋白抗體，4℃燙避光30 min，PBS洗滌2次，再重懸于500 μL的PBS進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.4 人外周血單個(gè)核細(xì)胞分離以及樹突狀細(xì)胞培養(yǎng) 外周血來(lái)自于湖北武漢血液中心的健康自愿獻(xiàn)血者。取經(jīng)過(guò)抗凝處理的外周靜脈血，按以下比例加入各種試劑:每10 mL外周血加入10 mLPBS混勻后輕輕加在10 mL的(Ficoll)分離液上層，在室溫下400 g離心30 min。小心吸取白膜層后加入10 mL的PBS，以200 g離心10 min，棄上清后重復(fù)洗滌3次。計(jì)數(shù)得到單個(gè)核細(xì)胞在12孔板中用含10%FCS的1640培養(yǎng)液重懸。每孔密度為2×109L-1，培養(yǎng)體系為2 mL，2 h后去除懸浮細(xì)胞，加入 rhGM-CSF(100 μg/L)和 rhlL-4(100 μg/L)以及10%FCS的1640培養(yǎng)液。隔天半量換液，補(bǔ)加細(xì)胞因子至上述濃度。8 d后收集細(xì)胞為人外周血來(lái)源DC。

1.3.5 卵巢癌HO-8910細(xì)胞與DC的混合培養(yǎng) 將1.3.1中各組HO-8910細(xì)胞和1.3.4中得到的DC在24孔板中進(jìn)行混合培養(yǎng)。HO-8910細(xì)胞 (4×105cells/孔)，DC(2×105cells/孔)，培養(yǎng)體系為 500 μL/孔。分別分為(1 μmol/L、2.5 μmol/L以及5 μmol/L)紫草素干預(yù)HO-8910細(xì)胞+DC組;(1 μmol/L、2.5 μmol/L 以及5 μmol/L)紫草素干預(yù) HO-8910細(xì)胞+DC組+鈣網(wǎng)織蛋白抑制性多肽(CRT inhibitor)組、未經(jīng)紫草素干預(yù)HO-8910細(xì)胞+DC組(對(duì)照組)、未經(jīng)紫草素干預(yù)HO-8910細(xì)胞+DC組+CRT inhibitor組、DC組(空白組)以及DC+CRT inhibitor組。24 h后半量換液1次，48 h后收集各組細(xì)胞進(jìn)行DC免疫表型檢測(cè)。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC膜表面CD1α和CD86的表達(dá)收集1.3.5中各組混合培養(yǎng)的細(xì)胞用PBS洗2遍，取5×108L-1細(xì)胞重懸于 200 μL PBS 中，加入10 μL FITC 標(biāo)記的 CD1α抗體，10 μL PE標(biāo)記的CD86抗體4℃燙避光孵育30 min后PBS洗滌2次，再重懸于500 μL PBS。隨后上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)，以CD1α單陽(yáng)性的細(xì)胞圈門進(jìn)行分析，CD1αCD86雙陽(yáng)性細(xì)胞占CD1α單陽(yáng)性細(xì)胞的比例即為DC表達(dá)CD86的陽(yáng)性率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 紫草素誘導(dǎo)卵巢癌HO-8910細(xì)胞發(fā)生凋亡情況 HO-8910細(xì)胞經(jīng)紫草素作用48 h后，細(xì)胞凋亡率與未經(jīng)紫草素處理的對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，并且細(xì)胞凋亡率與紫草素之間存在濃度依賴性。見(jiàn)圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定各組HO-8910細(xì)胞凋亡率

2.2 紫草素誘導(dǎo)卵巢癌HO-8910細(xì)胞膜表面表達(dá)鈣網(wǎng)織蛋白 HO-8910細(xì)胞經(jīng)紫草素作用48 h后，細(xì)胞膜表面的鈣網(wǎng)織蛋白表達(dá)率顯著上調(diào)，與未經(jīng)紫草素處理的對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，并且細(xì)胞膜表面鈣網(wǎng)織蛋白的表達(dá)率與紫草素之間存在濃度依賴性。見(jiàn)圖2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定各組HO-8910細(xì)胞鈣網(wǎng)織蛋白表達(dá)率

2.3 卵巢癌HO-8910細(xì)胞通過(guò)膜鈣網(wǎng)織蛋白促進(jìn)DC上調(diào)CD86表達(dá) 從外周血分離培養(yǎng)的 DC，純度在80%以上(CD1α陽(yáng)性率＞80%)。與HO-8910細(xì)胞混合培養(yǎng)的各組DC其CD86陽(yáng)性率均高于空白組DC(未經(jīng)過(guò)混合培養(yǎng))(P＜0.01);在混合培養(yǎng)的各組中，與經(jīng)過(guò)紫草素干預(yù)的 HO-8910細(xì)胞混合培養(yǎng)的DC其CD86陽(yáng)性率均高于與未經(jīng)過(guò)紫草素干預(yù)的HO-8910細(xì)胞混合培養(yǎng)的對(duì)照組DC(P＜0.01);而且隨著干預(yù)HO-8910細(xì)胞的紫草素濃度升高，與之混合培養(yǎng)的DC表達(dá)CD86陽(yáng)性率增加。為了進(jìn)一步探討HO-8910細(xì)胞刺激DC上調(diào)CD86表達(dá)與膜表面CRT的關(guān)系，在各組中加入CRT抑制性多肽(CRT inhibitor)。結(jié)果顯示CRT inhibitor均顯著抑制了與經(jīng)過(guò)紫草素處理的HO-8910細(xì)胞混合培養(yǎng)的DC上調(diào)表達(dá)CD86(P＜0.01);但是在對(duì)照組(與DC混合培養(yǎng)的HO-8910細(xì)胞未經(jīng)過(guò)紫草素處理)和空白組(未加入HO-8910細(xì)胞)，CRT inhibitor對(duì)于DC表面CD86的表達(dá)均無(wú)影響(P＞0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定各組DC細(xì)胞膜表面CD86分子表達(dá)率

3 討 論

近年研究發(fā)現(xiàn)，一些細(xì)胞毒性的藥物在誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的同時(shí)促使癌細(xì)胞膜表面表達(dá)CRT和HSP70等DC所識(shí)別的分子，通過(guò)與DC表面的配體相互作用，促進(jìn)DC吞噬并提呈腫瘤抗原，進(jìn)而刺激機(jī)體形成特異性致敏淋巴細(xì)胞，有助于重建腫瘤局部的免疫格局［5］。本實(shí)驗(yàn)顯示紫草素誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡的同時(shí)促使其在膜表面上調(diào)CRT表達(dá)，并且與人外周血來(lái)源的DC混合培養(yǎng)后促使DC上調(diào)其成熟標(biāo)志之一膜分子CD86。

CRT是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣結(jié)合蛋白，參與蛋白質(zhì)合成期間的折疊，并且通過(guò)綁定Ca2+增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+穩(wěn)定性［6］。新近研究發(fā)現(xiàn)，在凋亡期間CRT轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜表面能為DC以及其他吞噬細(xì)胞提供“eat-me”信號(hào)。敲除CRT蛋白后，凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)DC活化等免疫反應(yīng)亦隨之消失［7］。因此CRT的膜轉(zhuǎn)位可以加強(qiáng)死亡癌細(xì)胞的免疫原性。但是不同的促凋亡藥物誘導(dǎo)細(xì)胞免疫原性的差異很大，其機(jī)制不明。目前未發(fā)現(xiàn)治療卵巢癌的一線用藥鉑類能促使CRT等免疫原性分子上調(diào)。因此，配伍使用誘導(dǎo)癌細(xì)胞免疫原性死亡的藥物將有助于機(jī)體的抗腫瘤免疫。本研究發(fā)現(xiàn)中藥紫草的有效化學(xué)成分紫草素誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡率的同時(shí)膜表面CRT顯著升高，并且呈濃度依賴性。

DC是體內(nèi)重要的抗原提呈細(xì)胞，是特異性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)者，DC識(shí)別癌細(xì)胞并提呈腫瘤抗原對(duì)于觸發(fā)T細(xì)胞依賴的抗腫瘤免疫至關(guān)重要。未成熟的DC吞噬抗原后分化為成熟的DC，高表達(dá)共刺激分子CD80和CD86，這兩種分子亦是DC成熟的標(biāo)志之一［8］。CD86的表達(dá)要早于CD80，因此本實(shí)驗(yàn)選擇CD86作為一個(gè)成熟的早期標(biāo)志，并且觀察到卵巢癌細(xì)胞與DC混合培養(yǎng)后，隨著癌細(xì)胞CRT陽(yáng)性率上升，DC表達(dá)CD86陽(yáng)性率亦上調(diào)，在加入CRT抑制性多肽后能顯著抑制上述效應(yīng)，表明CRT在卵巢癌細(xì)胞促使DC成熟的過(guò)程中起了顯著作用。但是CRT抑制性多肽并不能完全抑制CD86的表達(dá)上調(diào)，而且與空白組相比，未發(fā)生凋亡的癌細(xì)胞亦能促使DC的CD86出現(xiàn)一定程度的上調(diào)。說(shuō)明癌細(xì)胞尚存在促使DC成熟的多種機(jī)制，有待進(jìn)一步的研究。

目前針對(duì)卵巢癌的化療雖然能直接損傷腫瘤細(xì)胞，但不能徹底殺傷腫瘤細(xì)胞。清除殘留的癌細(xì)胞仍有賴于機(jī)體重建有效的特異性抗腫瘤免疫。在本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)中藥的提取物紫草素能增強(qiáng)癌細(xì)胞的免疫原性，從而為臨床上建立化療誘導(dǎo)的卵巢癌免疫治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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