吳相春，王少卿，唐 璐，朱文浩，高 穎

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100700)

缺血性中風(fēng)嚴(yán)重威脅著人類健康，近年來我國缺血性中風(fēng)發(fā)病率呈上升趨勢，故其防治成為醫(yī)學(xué)研究的重要課題。中醫(yī)藥在缺血性中風(fēng)防治中發(fā)揮著重要作用，因此缺血性中風(fēng)動物模型中醫(yī)證候研究尤為必要。大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠模型是缺血性腦中風(fēng)研究的常用模型。本研究探討MCAO大鼠模型的中醫(yī)證候，為中醫(yī)藥防治缺血性中風(fēng)的辨證論治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康清潔級雄性SD大鼠70只，體質(zhì)量在280～300 g，由北京華阜康生物科技有限公司提供(許可證號SCXK(京)2009-0007)。飼養(yǎng)于北京東直門醫(yī)院中醫(yī)腦病研究室動物房，光照12 h/d，溫度20～23℃，相對濕度40% ～60%。正常飼料飲食，保持充足的飲水。

1.1.2 試劑 腎上腺皮質(zhì)酮(cortisone，CORT)酶聯(lián)免疫分析試劑盒，由北京北方生物技術(shù)研究所提供。MCAO線栓(A4級)由北京沙東生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將70只SD雄性大鼠分為手術(shù)組、假手術(shù)組、正常對照組，其中假手術(shù)組和手術(shù)組按照3個時點(diǎn)分為3個亞組，即缺血6 h、48 h、72 h組，每個亞組10只。正常對照組10只。

1.2.2 模型制作 手術(shù)組動物采用大腦中動脈線栓法制備MCAO動物模型，參照Longa線栓法［1］的基礎(chǔ)上加以改良，大鼠以3.5%的水合氯醛以1ml/100 g麻醉成功后仰臥固定，頸部正中切口1.5～2 cm，鈍性分離肌肉，以開瞼器暴露手術(shù)野，分離左側(cè)頸總動脈(CCA)及伴行的迷走神經(jīng)、頸外動脈(ECA)和頸內(nèi)動脈(ICA)，結(jié)扎CCA近心端，然后結(jié)扎ECA近心端，在距離CCA分叉處4 mm的血管壁上做一個小切口，輕輕插入線身直徑0.26 mm、線頭硅膠直徑(0.36±0.02)mm的線栓，使其頭端到達(dá)大腦中動脈起始處(從MCA至ECA分叉處約2 cm)，以抵觸感為度，將CCA遠(yuǎn)心端結(jié)扎，剪掉線栓以及其他的線，在創(chuàng)面上點(diǎn)幾滴青霉素液預(yù)防感染，縫合切口。術(shù)后3 h、6 h各評分1次，做好記錄。假手術(shù)對照只是不插入線栓，其余步驟同手術(shù)組。縫合傷口，將術(shù)后大鼠置于電熱毯保持體溫。術(shù)后3 h采用Zea-longa［1］5級4分法標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度評分。0分:無神經(jīng)功能缺損癥狀;1分:輕微神經(jīng)功能缺損，不能完全伸展右側(cè)前爪;2分:中度局灶性神經(jīng)功能缺損，向右側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:重度局灶性神經(jīng)功能缺損，向右側(cè)傾倒;4分:不能自發(fā)行走，意識水平下降。以分值≥1分作為造模成功的入組標(biāo)準(zhǔn)。造插線操作超過15 min、術(shù)中出血多麻醉過深呼吸不規(guī)律、術(shù)后3 h仍不能蘇醒的動物不列入統(tǒng)計(jì)范圍。

1.2.3 大鼠一般情況監(jiān)測 ①體質(zhì)量:體質(zhì)量變化分別在手術(shù)前、術(shù)后24 h、48 h、72 h進(jìn)行體質(zhì)量稱量、記錄;②模型動物精神、活動情況、皮毛、尾色、大便等。

1.2.4 神經(jīng)功能Zea-Longa評分 分別在術(shù)后 3 h、6 h、24 h、48 h、72 h 進(jìn)行神經(jīng)功能 Zea-Longa評分，評分由兩位實(shí)驗(yàn)人員共同觀察記錄，每只大鼠僅做1次神經(jīng)功能Zea-Longa評分，實(shí)驗(yàn)要求在單盲的條件下進(jìn)行。

1.2.5 放免法檢測血清CORT 實(shí)驗(yàn)?zāi)?，大鼠?jīng)麻醉后由腹主動脈取血3 ml加入空白試管中，4℃ 3000 r/min離心15 min，取上清置于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆茫琶夥z測血清CORT含量，由北京康源瑞德生物科技有限公司嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求進(jìn)行檢測。

1.2.6 腦組織形態(tài)學(xué)觀察 大鼠經(jīng)腹主動脈取血后夾閉腹主動脈，剪開胸部將灌注針由左心室穿入主動脈，依次注入0.9%生理鹽水和4%多聚甲醛。灌注30 min后，取出腦固定于4%多聚甲醛中24 h，石蠟包埋。經(jīng)HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠腦組織織形態(tài)學(xué)改變。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，多個樣本均數(shù)間的兩兩比較用最小顯著差法(least significant difference，LSD)。如方差不齊或不符合正態(tài)分布，用非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀況

一般大鼠在手術(shù)完成后1.5～2 h蘇醒，手術(shù)完成3 h后開始進(jìn)行評分，可見大鼠偏癱癥狀明顯，表現(xiàn)為右側(cè)肢體廢用或力弱、前肢力弱、后肢拖拽，行走呈順鐘向追尾狀，甚則向一側(cè)傾倒;此外還可觀察到，48 h、72 h手術(shù)組的大鼠在造模后24 h均出現(xiàn)左側(cè)瞼裂變小、左眼球腫脹并伴有分泌物，活動減少，身體蜷縮，體質(zhì)量明顯下降及肛周污染、稀便、舌質(zhì)紫暗等癥狀，各時點(diǎn)假手術(shù)組動物均未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量變化

表1顯示，與假手術(shù)組比較，術(shù)后24 h、48 h、72 h各時間點(diǎn)手術(shù)組大鼠體質(zhì)量均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)。

表1 術(shù)后各時間點(diǎn)大鼠體質(zhì)量變化比較(±s)

表1 術(shù)后各時間點(diǎn)大鼠體質(zhì)量變化比較(±s)

注:與假手術(shù)組比較:*P＜0.01

組 別 例數(shù) 實(shí)驗(yàn)體質(zhì)量 術(shù)后24 h 術(shù)后48 h 術(shù)后72 h假手術(shù)組10 239±8 236±10 244±12 236±11手 術(shù) 組 10 244±7 206± 7* 193±13* 186±11*

2.3 各組大鼠神經(jīng)功能Zea-Longa評分變化

表2顯示，與假手術(shù)組比較，各時間點(diǎn)手術(shù)組大鼠Zea-Longa神經(jīng)功能評分均明顯增高(P＜0.01)。

表2 術(shù)后各時間點(diǎn)大鼠神經(jīng)功能Zea-Longa評分變化比較(±s)

表2 術(shù)后各時間點(diǎn)大鼠神經(jīng)功能Zea-Longa評分變化比較(±s)

注:與假手術(shù)組比較:*P＜0.01

組 別 例數(shù) 術(shù)后3 h 術(shù)后6 h 術(shù)后24 h 術(shù)后48 h 術(shù)后72 h假手術(shù)組 10 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00手 術(shù) 組 10 2.46±0.78* 1.92±0.64* 1.15±0.38* 0.92±0.28* 1.00±0.00*

2.4 各組大鼠血清CORT水平變化

表3顯示，與正常組比較，假手術(shù)6 h、48 h、72 h組血清CORT有所升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);手術(shù)6 h、48 h、72 h組血清CORT明顯升高，與48 h、72 h組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。與假手術(shù)組比較，手術(shù)48 h、72 h組血清CORT明顯升高(P ＜0.05或P ＜0.01)。與手術(shù)6 h組比較，手術(shù)72 h組血清CORT明顯升高(P ＜0.01)。

表3 各組大鼠CORT變化比較(±s，ng/ml)

表3 各組大鼠CORT變化比較(±s，ng/ml)

注:與正常組比較:*P ＜0.01;與假手術(shù)組比較:#P ＜0.05，##P ＜0.01;與6 h組比較:△P ＜0.01

組 別 例數(shù)6 h 48 h 72 h正常對照組10 48.91±11.59 48.91±11.59 48.91±11.59假 手 術(shù) 組 10 54.43±9.58 53.90±13.86 54.48±15.60手 術(shù) 組 10 57.11±13.69 66.61± 9.44*# 70.88±10.09*##△

2.5 各組大鼠腦組織形態(tài)學(xué)觀察

正常組、假手術(shù)6 h、48 h組及假手術(shù)72 h組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)完整，排列緊密，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，胞漿呈粉紅色，胞核完整，核仁清晰，細(xì)胞周圍間隙無水腫，各時點(diǎn)均無炎性細(xì)胞浸潤，也無梗死灶。缺血6 h組缺血側(cè)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)破壞，排列紊亂，細(xì)胞體積大小不一，形態(tài)不規(guī)則，部分細(xì)胞空泡樣變，胞核深染，核膜不清，核仁不明顯，間質(zhì)疏松，呈網(wǎng)狀改變，血管周圍間隙增寬。缺血48 h組缺血側(cè)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元缺血性損害加重，進(jìn)一步變性壞死、溶解，間質(zhì)更加疏松，空泡樣變明顯。缺血72 h組缺血側(cè)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元缺血性損害進(jìn)一步加重，變性壞死、溶解，間質(zhì)更加疏松，空泡樣變明顯。

圖1 各組大鼠腦組織HE染色變化比較(400)

3 討論

中醫(yī)證候是機(jī)體生理病理整體反應(yīng)狀態(tài)的概括，四診信息實(shí)際上就是證候的表征。動物證候表征研究具有較好的穩(wěn)定性、可視性、可測性和可重復(fù)性［2］。MCAO大鼠模型是國內(nèi)外研究缺血性中風(fēng)的經(jīng)典模型，改進(jìn)后的線栓法簡便、易重復(fù)，降低了動物死亡率，提高了成功率，復(fù)制的可逆性局灶性腦缺血模型是研究腦缺血再灌注損傷較為理想的模型［3］。在MCAO大鼠模型、雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎大鼠模型、單側(cè)頸總動脈結(jié)扎大鼠模型的3種腦缺血模型中，MCAO模型可能為最合適的誘發(fā)血瘀證生物表征的腦缺血模型［4］。本研究結(jié)果顯示，MCAO大鼠模型呈現(xiàn)活動減少、蜷縮、精神萎靡、毛色枯槁、飲食減少、體質(zhì)量明顯下降、肛周污染、稀便、舌質(zhì)紫暗等癥狀，造模初期可見偏癱癥狀明顯，表現(xiàn)為右側(cè)肢體廢用或力弱，行走呈順鐘向追尾狀，甚則向一側(cè)傾倒。MCAO大鼠模型臨床表現(xiàn)符合腎虛血瘀證候標(biāo)準(zhǔn)［5］。

中醫(yī)認(rèn)為，“年四十而陰氣自半，起居衰矣”，年老腎精不足，元?dú)馓澨?，臟腑功能衰弱，肢體活動遲緩，氣血運(yùn)行緩慢，血流不暢致腦脈瘀滯不通而發(fā)中風(fēng)。正如《醫(yī)林改錯·王清任》曰:“半身不遂，虧損元?dú)猓瞧浔驹??！薄夺t(yī)學(xué)衷中參西錄·張錫純》亦云:“人之腦髓空者……甚或猝然昏厥，知覺運(yùn)動俱廢?！毕虑鹉X-垂體-腎上腺軸是機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)重要的組成部分。雖有報(bào)道顯示與正常人比較，腎陽虛患者尿17羥皮質(zhì)類固醇降低，而腎陰虛患者時高時低、變化不定［6］。但隨著年齡的增長，血清皮質(zhì)醇水平逐漸上升，高齡老年者更加明顯［7］。神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的功能失調(diào)將進(jìn)一步加重腦缺血再灌注后的神經(jīng)元損傷。腦缺血再灌注后2～24 h時間內(nèi)，實(shí)驗(yàn)大鼠血漿的ACTH、CORT含量明顯增高［8］。腦缺血后大鼠垂體體質(zhì)量明顯減輕，血漿CRH、ACTH和CORT濃度呈一致性先短暫升高后持續(xù)下降［9］。本研究結(jié)果顯示，模型大鼠在缺血6 h時血清CORT增高，隨著缺血時間的延長，血清CORT進(jìn)一步增高，表明大鼠存在神經(jīng)內(nèi)分泌功能紊亂。

MCAO 30 min缺血側(cè)基底結(jié)區(qū)首先出現(xiàn)大量的暗神經(jīng)元和壞死，至MCAO 1 h這些改變逐漸擴(kuò)展到皮層。如果組織持續(xù)缺血、壞死和暗神經(jīng)元將在組織水腫期后急劇增多，這些改變并不因組織灌注的恢復(fù)而逆轉(zhuǎn)［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型大鼠腦組織形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯改變，在梗死側(cè)皮層區(qū)神經(jīng)元數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)破壞，排列紊亂，而缺血48 h組、72 h組缺血側(cè)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元變性壞死、溶解，間質(zhì)更加疏松，空泡樣變明顯。

本研究從MCAO大鼠模型臨床表征及生物學(xué)基礎(chǔ)進(jìn)行探討，表明MCAO大鼠存在明顯的腎虛血瘀證候，為中醫(yī)藥研究腦中風(fēng)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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