畢亭亭，劉軍權，陳復興，劉 巖，朱炳喜

221002徐州，徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內科(朱炳喜);

221004徐州，解放軍第九七醫(yī)院實驗科(劉軍權、陳復興)

0 引 言

結腸癌是目前威脅人類健康最常見的惡性腫瘤之一，是一種以局部表現(xiàn)為主的全身性疾病。目前一般采用手術、化療、放療等方案治療結腸癌，但部分患者術后采用標準的化療方案仍無法避免腫瘤的早期復發(fā)［1］，因此提高其生存率成為治療的關鍵。隨著細胞免疫學的發(fā)展，生物治療逐漸成為研究的熱點。羽扇豆醇是一種可從草莓、芒果等多種果蔬以及植物中提取的五環(huán)三砧類化合物［2-4］，具有抗炎癥、抗氧化、促進創(chuàng)面愈合、抗腫瘤等作用［5］。有研究表明，一定濃度的羽扇豆醇能促進γδ T細胞的生長及其對胰腺癌細胞的殺傷作用［6］，但有關羽扇豆醇在體外對人共刺激細胞殺傷結腸癌細胞株SW480的報道國內外鮮見。因此，本研究探討羽扇豆醇對人共刺激細胞殺傷結腸癌細胞株SW480生長的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人結腸癌細胞株SW480(購于上海細胞生物研究所，本室傳代保存);羽扇豆醇(lupeol)(Sigma公司);胰蛋白酶、RPMI 1640(GIBCO公司);人AB血清(徐州市血站);胎牛血清、淋巴細胞分離液(中國科學院血液病研究所);二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、甲基偶唑藍(MTT)(美國Sigma公司);恒溫CO2培養(yǎng)箱公司、倒置顯微鏡(德國Wilovert公司);超凈工作臺、低溫離心機 (北京希亞克技術有限公司);ST-360酶標儀(上?？迫A實驗系統(tǒng)有限公司);Encore自動生化分析儀(北京希亞克技術有限公司);流式細胞儀(flow cytometer，F(xiàn)CM)(美國BD公司)。

1.2 共刺激細胞的培養(yǎng) 取10份健康人外周抗凝血每份10 mL，用淋巴細胞分離液分離單個核細胞(離心半徑12 cm，1500 r/min離心15 min)，吸取單個核細胞層，等滲鹽水洗滌3次(離心半徑12 cm，1500 r/min離心，10 min/次)，用RPMI l640 培養(yǎng)液(含 rhIFN-γ 2×106U/L、100 mL/L小牛血清、50 mL/L人AB血清)調整細胞密度為5×108/L，接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔5 mL，置37℃、50 mL/L CO2環(huán)境培養(yǎng)24 h后收集細胞，離心棄上清液后用RPMI 1640洗滌1次。用RPMI 1640完全培養(yǎng)液(含100 mL/L小牛血清、50 mL/L人AB血清、IL-1α 10 μg/L、rhIL-2 5 × 104U/L、CD3 mAb 1mg/L)調整細胞密度為5×108/L，接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔5 mL，然后根據分組分別加入下列細胞刺激因子:IL-15 20 μg/L、IL-21 10 μg/L、CD28 10 mg/L單抗，于37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天半量換培養(yǎng)基(含相應的細胞刺激因子)1次，并調整細胞密度為5×108/L。收集共刺激細胞做相關檢測。

1.3 人結腸癌細胞株SW480的培養(yǎng) 將復蘇后的細胞配成1.75×104/L的細胞懸液，置于細胞培養(yǎng)瓶中，在37℃、50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)，2～3 d更換細胞培養(yǎng)液，細胞達 80%瓶底時，以 0.02%EDTA消化脫壁，收集細胞，離心半徑 12 cm，800 r/min離心3 min，棄去上清備用。

1.4 羽扇豆醇原液的配制 羽扇豆醇純度≥95%，取3 mg，用溫無水乙醇和二甲基亞砜(DMSO)按1∶1混勻，配成原液濃度為40 mg/mL，放入-20℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 MTT法檢測 將對數生長期的結腸細胞株SW480及培養(yǎng)7 d的共刺激細胞分別配成1.75×104/L、4×104/L的細胞懸液，均接種于96孔板中，0.2 mL/孔，加入不同濃度的羽扇豆醇(終濃度分別為200 mg/L，倍比稀釋至0.005 mg/L)。同時設空白和溶劑(每孔加入與溶解羽扇豆醇等量的溶劑)對照組，每組設3個復孔，孵育24、48、72h后每孔加人MTT(5 g/L)液20 μL，37℃培養(yǎng)箱孵育4 h后棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，輕輕震蕩10 min使其充分溶解，在540 nm波長酶標儀上測定各孔吸光度值(A)。每試驗重復3次，求其平均值，并計算細胞生長抑制率和細胞生長增殖率，公式如下:

細胞生長抑制率(%)=(對照A值-實驗A值)/對照A值×100%

細胞生長增殖率(%)=(實驗A值-對照A值)/對照A值×100%

1.6 LDH法檢測共刺激細胞對SW480的殺傷活性

1.6.1 共刺激細胞對羽扇豆醇誘導后的結腸癌細胞株SW480殺傷活性的檢測 將培養(yǎng)7d的共刺激細胞(效應細胞)及經羽扇豆醇(終濃度為 0.4、0.8、1.6、3.1、6.2、12.5、25.0、50.0 mg/L，濃度選擇根據 MTT結果)誘導的對數期生長結腸癌SW480細胞(靶細胞)分別用含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640配成2×109/L和2×108/L細胞懸液。各取0.5 mL效靶細胞懸液充分混合，置37℃、50mL/L CO2孵箱中孵育6h后，離心半徑為12cm，1500r/min離心10min收集上清液，按乳酸脫氫酶試劑盒要求操作，在全自動生化分析儀340 nm波長下測定LDH的活性單位(U/L)。每測試樣本均設未加羽扇豆醇的對照組。同時檢測單靶細胞的自然釋放值和單效應細胞的自然釋放值。每份測試樣本重復3次，取平均值。

1.6.2 羽扇豆醇誘導后的共刺激細胞對結腸癌細胞株SW480的殺傷活性檢測 取將經羽扇豆醇(終濃度為0.4、0.8、1.6、3.1、6.2、12.5、25.0、50.0mg/L)誘導培養(yǎng)7d的共刺激細胞(效應細胞)及對數期生長的結腸癌SW480細胞(靶細胞)分別配成2×109/L和2×108/L細胞懸液。余操作步驟及檢測方法同1.6.1。計算共刺激細胞殺傷活性，公式如下。

共刺激細胞殺傷活性(%)=(測定管LDH單位-效應細胞自然釋放LDH管)/(靶細胞最大釋放LDH管-靶細胞自然釋放LDH管)×100%

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料使用平均數±標準差(±s)表示。組間均數比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，多組間兩兩比較用Dunnet t檢驗。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 共刺激細胞形態(tài)學觀察結果 共刺激細胞為貼壁細胞，在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)24 h后動態(tài)觀察細胞出現(xiàn)明顯增殖現(xiàn)象，培養(yǎng)3 d后可見小集落狀細胞，7 d后出現(xiàn)大的集落細胞生長，見圖1。

2.2 羽扇豆醇對人共刺激細胞生長的影響 不同濃度的羽扇豆醇作用人共刺激細胞24、48、72 h后，濃度在0.1～12.5 mg/L時對人共刺激細胞的生長有促進作用，且隨著濃度的逐漸升高細胞增殖率升高，濃度在12.5～100.0 mg/L時，其促進作用逐漸減弱，100.0～200.0 mg/L之間促進作用不再有明顯變化，72 h濃度為12.5 mg/L時增殖率達到最大值，見圖2。24、48、72 h各濃度組與空白對照組比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，空白對照組與溶劑對照組比較均無統(tǒng)計學意義，見表1。

2.3 羽扇豆醇對結腸癌細胞株SW480生長的影響羽扇豆醇作用于結腸癌細胞株SW480 24、48、72 h后，在0.05～200.0 mg/L時，對 SW480的生長有抑制作用，隨著濃度的升高抑制率逐漸上升，呈濃度依賴性，25.0 mg/L時抑制率開始顯著增高，見圖3。24、48、72 h各濃度組與空白對照組、溶劑對照組比較均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，空白對照組與溶劑對照組比較均無統(tǒng)計學意義，見表2。

圖1 顯微鏡下培養(yǎng)7 d共刺激細胞形態(tài)Figure 1 The shape of Co-stimulation cells under the microscope at the 7th day

圖2 不同濃度羽扇豆醇對共刺激細胞生長的影響(n=3)Figure 2 Effects of different concentrations of Lupeol on the growth of Co-stimulation cells(n=3)

表1 羽扇豆醇作用不同時間后人共刺激細胞的A值比較(±s，n=3)Table 1 Different concentrations of Lupeol effect on Co-stimulation cells after 24 h、48 h、72 h(±s，n=3)

表1 羽扇豆醇作用不同時間后人共刺激細胞的A值比較(±s，n=3)Table 1 Different concentrations of Lupeol effect on Co-stimulation cells after 24 h、48 h、72 h(±s，n=3)

與各時間點空白對照組比，*P＜0.05

組 別A值24 h 48 h 72 h空白對照組0.2967 ±0.0025 0.2986 ±0.0025 0.3030 ±0.0010溶劑對照組 0.2987 ±0.0031 0.3003 ±0.0015 0.3040 ±0.0044羽扇豆醇組(mg/L)0.005 0.3030 ±0.0036* 0.3063 ±0.0031* 0.3083 ±0.0015 0.01 0.3060 ±0.0020* 0.3097 ±0.0015* 0.3127 ±0.0025*0.025 0.3117 ±0.0021* 0.3153 ±0.0040* 0.3217 ±0.0021*0.05 0.3170 ±0.0010* 0.3203 ±0.0025* 0.3450 ±0.0030*0.1 0.3233 ±0.0031* 0.3373 ±0.0015* 0.3483 ±0.0025*0.2 0.3277 ±0.0015* 0.3443 ±0.0025* 0.3710 ±0.0026*0.4 0.3377 ±0.0031* 0.3597 ±0.0015* 0.3920 ±0.0036*0.8 0.3520 ±0.0053* 0.3843 ±0.0040* 0.4363 ±0.0035*1.6 0.3600 ±0.0020* 0.3916 ±0.0015* 0.4523 ±0.0025*3.1 0.3613 ±0.0032* 0.3966 ±0.0021* 0.4687 ±0.0030*6.2 0.3670 ±0.0026* 0.4180 ±0.0020* 0.4803 ±0.0051*12.5 0.3753 ±0.0025* 0.4356 ±0.0021* 0.5163 ±0.0045*25.0 0.3577 ±0.0025* 0.3927 ±0.0031* 0.4650 ±0.0046*50.0 0.3480 ±0.0026* 0.3640 ±0.0036* 0.4250 ±0.0056*100.0 0.3203 ±0.0025* 0.3313 ±0.0061* 0.3417 ±0.0035*200.0 0.3177 ±0.0025* 0.3240 ±0.0056* 0.3360 ±0.0020*

表2 羽扇豆醇作用后SW480細胞的A值(±s，n=3)Table 2 Effect of different concentrations of Lupeol on the A value of SW480 cells(±s，n=3)

表2 羽扇豆醇作用后SW480細胞的A值(±s，n=3)Table 2 Effect of different concentrations of Lupeol on the A value of SW480 cells(±s，n=3)

與各時間點空白對照組及溶劑對照組相比，*P＜0.05

組 別A值24 h 48 h 72 h空白對照組0.3943 ±0.0038 0.3776 ±0.0025 0.4047 ±0.0042溶劑對照組 0.3920 ±0.0020 0.3770 ±0.0020 0.4017 ±0.0032羽扇豆醇組(mg/L)0.005 0.3867 ±0.0042* 0.3650 ±0.0026* 0.3883 ±0.0038*0.01 0.3840 ±0.0035* 0.3613 ±0.0031* 0.3837 ±0.0051*0.025 0.3817 ±0.0032* 0.3573 ±0.0031* 0.3773 ±0.0050*0.05 0.3787 ±0.0031* 0.3527 ±0.0031* 0.3687 ±0.0065*0.1 0.3780 ±0.0036* 0.3493 ±0.0025* 0.3550 ±0.0050*0.2 0.3740 ±0.0044* 0.3413 ±0.0015* 0.3350 ±0.0066*0.4 0.3710 ±0.0036* 0.3226 ±0.0025* 0.3090 ±0.0078*0.8 0.3690 ±0.0026* 0.3033 ±0.0031* 0.2970 ±0.0062*1.6 0.3663 ±0.0031* 0.2940 ±0.0036* 0.2917 ±0.0025*3.1 0.3626 ±0.0040* 0.2893 ±0.0035* 0.2870 ±0.0036*6.2 0.3583 ±0.0015* 0.2863 ±0.0040* 0.2830 ±0.0056*12.5 0.3530 ±0.0026* 0.2803 ±0.0049* 0.2797 ±0.0055*25.0 0.3487 ±0.0023* 0.2763 ±0.0032* 0.2753 ±0.0047*50.0 0.3173 ±0.0025* 0.2600 ±0.0050* 0.2433 ±0.0050*100.0 0.2820 ±0.0053* 0.2417 ±0.0021* 0.2256 ±0.0076*200.0 0.2537 ±0.0057* 0.2180 ±0.0020* 0.1963 ±0.0015*

圖3 羽扇豆醇對SW480生長的影響(n=3)Figure 3 Effect of Lupeol on the growth of SW480 cells(n=3)

2.4 共刺激細胞對SW480的殺傷活性影響

2.4.1 共刺激細胞對羽扇豆醇作用后的SW480的殺傷作用 濃度在0.4～12.5 mg/L時，共刺激細胞對SW480的殺傷活性明顯高于空白對照組，濃度為12.5 mg/L時殺傷活性最強(71%)，與空白對照組(38%)比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。當濃度超過12.5 mg/L后，殺傷活性開始下降，見圖4。

圖4 共刺激細胞對羽扇豆醇作用后的SW480的殺傷作用(n=3)Figure 4 The killing effects of the Co-stimulation cells on SW480 cells cultured with Lupeol(n=3)

2.4.2 羽扇豆醇誘導后的共刺激細胞對SW480的殺傷作用 濃度在0.4～12.5 mg/L時，共刺激細胞對SW480的殺傷活性顯著升高，12.5 mg/L達到最大值(76%)，與空白對照組(40%)比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。當濃度超過12.5 mg/L后，殺傷活性開始下降，見圖5。

圖5 羽扇豆醇誘導后的共刺激細胞對SW480的殺傷作用(n=3)Figure 5 The killing effects of the Co-stimulation cells which cultured with Lupeol on SW480 cells(n=3)

3 討 論

羽扇豆醇具有抗炎止痛、抗糖尿病等藥理活性［8-9］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)羽扇豆醇也具有抗腫瘤的作用，張琳和張有成［10］的研究表明羽扇豆醇對黑色素瘤、白血病、皮膚癌、胰腺癌、乳腺癌都有抗腫瘤作用，抗腫瘤機制主要是誘發(fā)腫瘤凋亡、阻斷腫瘤細胞的信號傳導通路，抑制腫瘤血管生成及轉移。

細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer，CIK)是多種刺激因子聯(lián)合誘導活化的NK樣T細胞。不僅具有T淋巴細胞特異性抗瘤活性，而且有NK細胞的非MHC限制性殺瘤特性，其增值速度快、殺傷活性高、殺瘤譜廣、副作用小和對正常骨髓造血影響輕等優(yōu)點而被廣泛應用于腫瘤的過繼性免疫治療［11］。許多研究發(fā)現(xiàn)，添加不同的共刺激因子對T細胞的增殖和抗腫瘤效應有一定的影響。在T細胞培養(yǎng)體系中增加CD28mAb，可促進其增殖［12］;加入 IL-15能抑制 T細胞的凋亡及其中 IFN-γ、TNF-α的分泌［13］;加入 IL-21 可促進腫瘤組織中Th17細胞的分化［14］，參與固有免疫及適應性免疫［15］，加入IL-2、IL-15來增強 T細胞的細胞毒活性并促進 IFN-γ 的分泌［16］，促進記憶 T細胞的增殖［17］。在常規(guī) CIK細胞培養(yǎng)基中加入刺激因子(CD3、CD28、IFN-γ、IL-2、IL-1α、IL-15 和 IL-21)后，發(fā)現(xiàn)這樣不僅能促進細胞增殖，而且能提高特異性細胞毒T細胞的擴增，增加記憶性細胞比值［18］。將這些細胞因子刺激后得到的T細胞稱為共刺激細胞。與CIK細胞的區(qū)別在于其培養(yǎng)前后細胞表型CD3、CD56、CD107a的表達明顯高于CIK細胞，具有比CIK細胞更強的抗腫瘤活性。有研究證實，共刺激細胞有抗胃癌SGC-7901、SW-1990和SW-1116細胞的作用［18］，其抗腫瘤的機制主要是通過釋放穿孔素、顆粒酶而裂解靶細胞。穿孔素是存在于細胞毒性T淋巴細胞、自然殺傷細胞和γδT細胞胞質中的細胞毒顆粒，當這些細胞與靶細胞接觸后可釋放穿孔素，在靶細胞膜上形成多聚穿孔素管狀通道，導致靶細胞溶解破壞［19］。顆粒酶B是殺傷性T淋巴細胞和NK細胞顆粒中最重要的絲氨酸蛋白酶，通過Caspases依賴途徑、直接入核途徑及不依賴Caspases的胞質途徑殺傷靶細胞［20］。T細胞表面的CD107a分子，與抗原特異性細胞活化后的脫顆粒過程有關，脫顆粒則是穿孔素、顆粒酶依賴性靶細胞殺傷過程的關鍵步驟［21］。但共刺激細胞對抗結腸癌的報道尚不多見。

既往我們研究已證實，羽扇豆醇在一定時間、一定的濃度范圍內能促進γδ T細胞、NK細胞的生長，抑制胰腺癌［6］、胃癌［22］細胞的增殖，增強 γδ T 細胞、NK細胞對胰腺癌、胃癌的殺傷活性。本實驗主要研究羽扇豆醇誘導后共刺激細胞殺傷結腸癌的作用，結果發(fā)現(xiàn)羽扇豆醇的濃度在0.1～12.5 mg/L范圍內對共刺激細胞的生長有促進作用，超過12.5 mg/L促進作用開始減弱，這說明在適當的濃度范圍內，羽扇豆醇能促進共刺激細胞的生長。隨著濃度的逐漸升高，羽扇豆醇對結腸癌細胞株SW480的抑制作用逐漸增強，說明其有抗結腸癌細胞增殖的作用。另外，羽扇豆醇誘導后，共刺激細胞對結腸癌細胞株SW480的殺傷活性明顯增強，說明羽扇豆醇不僅能提高SW480對共刺激細胞的敏感性，而且能提高共刺激細胞對SW480的殺傷能力。其機制可能與羽扇豆醇能上調共刺激細胞內穿孔素、顆粒酶、CD107a的表達有關，其對共刺激細胞信號通路的影響還需進一步研究。

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