張 煒，陳 忠，龍漢利，莊國慶，李曉清

(1.四川省林業(yè)科學研究院，四川成都 610081，2.內江市東興區(qū)雙才林業(yè)工作站，四川內江 641100)

白化苗是是葉片中含葉綠素較少或不含葉綠素的植物幼苗。葉綠素的缺失導致植物不能進行正常的光合作用和生長發(fā)育。光合作用對植物來說是必不可少的，光合作用正常與否，對植物生長有重要影響。研究白化苗的成因進而控制其形成是當前作物育種中亟待解決的一個問題。很多研究發(fā)現(xiàn)在多種農(nóng)作物的實生苗或組培苗中存在白化苗，如水稻(Oryza sativa L.)［1］、小麥 (Triticumaestivum L.)［2］、大麥 (Hordeumvulgare L.)［3］、高粱 (Sorghum bicolor(L.)Moench)［4］、玉米 (Zea mays L.)［5］、煙草(Nicotianatabacum L.)［6］、棉花 (Gossypiumhirsutum L.)［7］、甘蔗 (Saccharumsinensis Roxb.)［8］、薏苡(Coixlacrymajobi L.)［9］、雷竹(Phyllostachys praecox C.D.Chu et C.S.Chao)［10］。白化苗不但在農(nóng)作物中較為普遍，在樹木中也有發(fā)現(xiàn)，如蘇鐵(Cycasrevoluta Thunb.)［11］、藍桉 (Eucalyptus globulus Labill.)［12］、版納省藤 (Calamus nambariensis Becc.var. xishuangbannaensis S. J. Pei etS. Y.Chen)［13］、椰子樹(Cocos nucifera)［14］。白化苗產(chǎn)生的原因有兩種，一種是由于生理上的變化引起的;另一種是DNA序列產(chǎn)生了突變。生理上的變化是白化苗形成的外因，包括抗生素［15］、磷和鋅［5］、預處理［16］、低溫［17］、脈動磁場［18］、不同雜交材料［19］和不同倍性［20］等因素對植物產(chǎn)生白化苗的影響。DNA序列的變異可導致白化苗與正常綠苗葉片的超微結構［11，21］、過氧化物同工酶［22，23，9］、脂酶同工酶［9，22］、可溶性蛋白質［22，24］和質體亞顯微結構［25］等方面具有明顯的差異，這些差異可能與白化苗的形成有關。遺傳學上的研究表明，白化苗遵從單基因分離規(guī)律，認為白化苗可以作為評估樹木遠親繁殖率的指標［12］，但也有相反的研究結果［26］。楨楠(Phoebe zhennan S.Lee＆F.N.Wei)是我國重要的經(jīng)濟樹種，但目前有關楨楠的研究較少，有關楨楠白化苗的研究迄今還未見有報道?；诖耍疚膶E楠白化苗與正常苗的AFLP譜帶進行了比較分析。

1 材料

本研究的試驗材料為楨楠實生苗。2011年10月份由四川省林業(yè)科學研究院在四川、云南、重慶、貴州、湖北和湖南6個省采集苗木種子。按棵采集，每一棵上采到的種子作為一個家系，共采集92個家系，每個家系50棵，2012年3月份將種子播于裝有土壤的塑料花盆中，采用相同的營養(yǎng)土質栽培、相同的營養(yǎng)液澆灌，以及相同的光照、溫度與濕度管護。

圖1 楨楠正常苗(左)和白化苗(右)

實驗所用的試劑有購自Biolabs的限制性內切酶EcoRI和 MseI;購自天根生物科技有限公司(Tiangen，北京)的 T4連接酶、TaqDNA聚合酶、dNTPs和甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、尿素，瓊脂糖、Tris飽和酚等有機試劑;購自Solarbio公司的親和硅烷、剝離硅烷;由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成引物。

實驗所用到得儀器有電子天平(Sartorious)、高速冷凍臺式離心機(Thermo)、蒸汽滅菌器、Bio-Rad(MC013208)PCR擴增儀、水平電泳儀(BIO-RAD)和Gene Genius Bio-imaging System凝膠成像凝膠成像系統(tǒng)、北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYCZ-20C型垂直電泳系統(tǒng)，UV-VIS Spectrophotometer(Tu-1901型)紫外分光光度儀、搖床以及其它一些常用的實驗設備。

2 研究方法

2.1 測定白化苗發(fā)生率

2012年7月統(tǒng)計每個家系白化苗的株數(shù)和該家系的總株數(shù)。

白化苗發(fā)生率=每個家系白化苗的株數(shù)/該家系的總株數(shù)·100%。

2.2 基因組DNA的提取

供試材料種子發(fā)芽后，分別取白化苗和正常苗的新鮮嫩葉，基因組DNA提取參照Zhang等的實驗方法［21］，所得的白化苗基因組DNA和正常苗基因組DNA分別用1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測，用Gene Genius Biolmaging Sysetm凝膠成像系統(tǒng)在紫外光下拍照，可以粗略估算出各樣品的DNA濃度，同時還可檢測總DNA分子的大小以及是否降解。最后統(tǒng)一將DNA濃度調整為40 ng·μl-1，均保存于 -20℃冰箱備用。

2.3 AFLP擴增

利用實生苗、白化苗的DNA樣品對56個引物組合進行了篩選，根據(jù)最終聚丙烯酰胺凝膠上反映出的條帶數(shù)目、清晰度、多態(tài)性以及重復性情況來篩選適用的AFLP引物。

PCR 反應體系:體積為 25 μl，3 μl模板 DNA，擴增引物(50 pm·μl-1)各 1.0 μl，2 μl dNTPs(10 mM·μl-1)，0.2 μl Taq DNA 聚合酶 (5 U·μl-1)，1.5 μl MgCl2(25 mM)，補充超純水至 25 μl。PCR反應程序:94℃預變性2 min;94℃變性30 s，65℃退火(每個循環(huán)降低0.7℃)30 s，72℃延伸1 min，12個循環(huán);94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，23個循環(huán);最后72℃延伸5 min;置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳

反應結束后，選擇性擴增產(chǎn)物與上樣緩沖液(98%甲酰胺;10 retool/L EFrA，pH8.0;0.250k溴酚藍;0.25%二甲苯青FF)等體積混合，95℃變性6 min.立刻將PCR管放到冰上待用。本實驗中采用聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染的方法進行檢測執(zhí)。銀染后的板晾干后在膠片觀察燈下觀察，選擇那些具有清晰、電泳帶易計數(shù)的引物作為AF'LP反應的最佳引物。

3 結果與分析

3.1 白化苗發(fā)生率

在收集的92個家系中有5個家系出現(xiàn)1株～2株白化苗，其白化苗發(fā)生率在2%～4%之間，這與高梁和玉米實生苗的5%以下的白化苗發(fā)生率相近［4，5］。

3.2 引物篩選結果

利用實生苗、白化苗的DNA樣品對56個引物組合進行了篩選，根據(jù)最終聚丙烯酰胺凝膠上反映出的條帶數(shù)目、清晰度、多態(tài)性以及重復性情況，選擇出了16個引物組合，利用這16對引物檢測白化苗與正常綠色苗的DNA差異條帶的篩選引物，具體情況見表1。

3.3 AFLP譜帶分析

16對AFLP引物中，發(fā)現(xiàn)有兩對引物組合(P6和P11)能在正常苗和白化苗中產(chǎn)生差異條帶。其中引物P6在白化苗樣品中擴增的條帶比在正常綠苗少一條，即白化苗缺失一條帶，缺失的這條帶大小為950 bp左右(圖2左)。而引物P11在白化苗樣品中擴出的條帶比正常綠苗多一條，即白化苗多一條帶，多出的這條帶的大小為1 150 bp左右(圖2右)。差異條帶的出現(xiàn)說明白化苗與正常苗在DNA序列上是有差異的。

表1 AFLP引物篩選結果表

4 討論

本研究中兩對差異性篩選引物P6(EACG/MCCG)和 P11(EATC/MCGT)，獲得了兩條差異性DNA片段，重復驗證實驗證明這兩條多態(tài)性條帶能夠穩(wěn)定區(qū)分楨楠的白化苗與綠色苗。植物中白化苗性狀成因主要有兩個，第一是跟DNA序列的突變相關，另外還可能與植物所處的環(huán)境以及生理上的變化相關，目前還缺乏兩者相關的直接證據(jù)。根據(jù)本單位關于楨楠種子萌發(fā)與幼苗栽培的實驗，我們使用采集的楨楠種子，在四川省林業(yè)科學研究院繁殖花圃中萌發(fā)并管護，實施相同的營養(yǎng)土質栽培、相同的營養(yǎng)液澆灌，以及相同的光照、溫度與濕度管護，依然發(fā)現(xiàn)了部分白化苗性狀的出現(xiàn)，因此推測楨楠白化苗的產(chǎn)生可能與環(huán)境生理的差異性原因無太大關聯(lián)，而主要源于其體內DNA的突變。這也是我們采用AFLP方法，從分子生物學的基因組學角度入手研究楨楠白化苗成因的理由。

圖2 引物P6在正常苗中擴出的特異性條帶(左)、引物P11在白化苗中擴出的特異性條帶(右)

DNA序列發(fā)生差異可能是由堿基突變，堿基或片段的插入，堿基或片段的缺失等引起的。Ellis(1985)研究發(fā)現(xiàn)小麥白化苗的質體DNA有大段缺失，不同的白化苗缺失片段及缺失量不同［27］。楊莉等(1998)利用RFLP技術研究了小麥返白系葉綠體DNA的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)親緣關系較近的兩個小麥品種的白化苗的Hind Ш 酶切片段有差異，他們認為這種差異可能是由于cDNA發(fā)生點突變，小片段插入或缺失所造成的［28］。張漢堯等(2005)研究表明矮牽牛的白化可能是由于葉綠體DNA水平上的堿基變化所引起的［29］。本研究中，究竟是堿基的突變，還是缺失或插入導致白化苗與正常綠苗的AFLP譜帶發(fā)生差異，還需進一步的測序比較分析，從核苷酸序列水平真正揭開楨楠白化苗的基因組突變成因。

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