蔣 玲，李正一，周志強(qiáng)，陳秀萍，雷鳳英，覃遠(yuǎn)漢

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530021）

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）屬于配體激活的核細(xì)胞受體超家族，為Ⅱ型核激素受體超家族成員，有 α、β、γ 三種亞型［1］。在腎臟內(nèi)，PPARγ參與正常腎臟的發(fā)育、脂質(zhì)代謝，具有調(diào)節(jié)水鹽重吸收、調(diào)控腎血流量并激活腎素—血管緊張素系統(tǒng)等生理功能［2，3］。目前，在單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，PPARγ具有抗腎間質(zhì)纖維化（RIF）作用［4］。然而PPARγ在體外培養(yǎng)的缺氧性腎小管上皮細(xì)胞（RTEC）中的表達(dá)及作用尚不清楚。2012年12月～2013年6月，為探討PPARγ在缺氧性RTEC損傷中的作用，我們進(jìn)行了相關(guān)研究?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠缺氧性RTEC細(xì)胞株（NRK-52E）購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù);DMEM高糖培養(yǎng)基、超濾胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone有限公司;羅格列酮（RGZ）、GW9662購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;二甲基亞砜購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司;其他均為常規(guī)儀器和試劑。

1.2 方法

1.2.1 模型制作及分組 將NRK-52E于37℃、5%CO2條件下置入含5%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%融合時(shí)傳代。待傳代的細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，將細(xì)胞隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照組、缺氧模型組、RGZ組及GW9662組。正常對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)，不予缺氧性損傷處理。缺氧模型組、RGZ組及GW9662組行缺氧性損傷處理［5］，同時(shí)RGZ組給予15 μmol/L RGZ、GW9662組給予25 μmol/L GW9662處理。36 h后收集細(xì)胞行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.2 PPARγ、TGF-β1mRNA 表達(dá)檢測(cè) 采用 RTPCR法。按照RNA提取試劑盒說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA，選取完整的mRNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，β-actin為內(nèi)參。PPARγ上游引物:5＇-GATGACCACTCCCATTCCTTT-3＇，下 游 引 物:5＇-CGCACTTTGGTATTCTTGGAG-3＇，片 段 長(zhǎng) 度 156 bp。TGF-β1上 游 引 物:5＇-CGCAATCTATGACAAAACCAAA-3＇，下 游 引 物:5＇-TTCTACGTGTTGCTCCACAGTT-3＇，片段長(zhǎng)度 154 bp。β-actin 上游引物:5＇-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3＇，下 游 引 物:5＇-CCCATACCCACCATCACACC-3＇，片段長(zhǎng)度 207 bp。反應(yīng)體系為20 μL:2.5 ×Real MasterMix/SYBR solution 9.0 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.4 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.4 μL，cDNA 1 μL，超純水9.2 μL。PCR 反應(yīng)條件:PPARγ:95 ℃預(yù)變性 10 min，68 ℃變性15 s，62 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán);TGF-β1:95℃預(yù)變性10 min，68 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每樣本重復(fù)3次。以正常對(duì)照組的基因表達(dá)量為 1，采用相對(duì)定量 2-ΔΔCT法［6］計(jì)算其余各組mRNA的相對(duì)表達(dá)量。變化倍數(shù)（Fold change）為缺氧模型組、RGZ組和GW9662組較正常對(duì)照組基因的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)。

1.2.3 PPARγ、TGF-β1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法。按常規(guī)方法提取NRK-52E的總蛋白，二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。4℃、12 000 r/min離心后加入上樣緩沖液，煮沸變性后行Western blot檢測(cè)。以β-actin為內(nèi)參，行10%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）、封閉液室溫封閉1 h、一抗4℃孵育過(guò)夜、二抗常溫避光孵育1.5 h，最后掃描PVDF分析蛋白表達(dá)量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，比較采用單因素方差分析q檢驗(yàn)（SNK法）。相關(guān)性分析采用直線(xiàn)相關(guān)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RTEC形態(tài)觀察 正常對(duì)照組RTEC形狀渾圓，細(xì)胞間隙清晰。缺氧模型組RTEC形狀變尖銳，出現(xiàn)萎縮，細(xì)胞間隙變寬加深，且寬度不一，細(xì)胞壁出現(xiàn)塌陷。與缺氧模型組比較，RGZ組RTEC萎縮減輕，細(xì)胞間隙變窄，細(xì)胞壁塌陷程度較輕;GW9662組RTEC萎縮加重，細(xì)胞間隙變寬。

2.2 各組 RTEC PPARγ、TGF-β1mRNA 表達(dá)比較見(jiàn)表1。

表1 各組RTEC PPARγ、TGF-β1mRNA表達(dá)比較

2.3 各組 RTEC PPARγ、TGF-β1蛋白表達(dá)比較見(jiàn)表2。

表2 各組 RTEC PPARγ、TGF-β1蛋白表達(dá)比較（ ±s）

表2 各組 RTEC PPARγ、TGF-β1蛋白表達(dá)比較（ ±s）

注:與正常對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與缺氧模型組比較，#P ＜0.05

組別 n PPARγ TGF-β1正常對(duì)照組9 5.13 ±0.15 3.48 ±0.06缺氧模型組 9 4.28 ±0.39* 5.32 ±0.07*RGZ 組 9 4.85 ±0.11*# 4.75 ±0.09*#GW9662 組 9 2.27 ±0.17*# 7.49 ±0.12*#

2.4 缺氧性 RTEC 損傷中 PPARγ、TGF-β1蛋白表達(dá)的關(guān)系 缺氧性RTEC中PPARγ的蛋白表達(dá)與TGF-β1的蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.91，P＜0.05）。

3 討論

RTEC損傷是指腎小管受到缺氧、炎性因子、蛋白尿等因素作用后，RTEC活化、增殖，炎性因子分泌增加，并導(dǎo)致上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（EMT）。而EMT是RIF的早期可逆性階段，也是終末期腎病的主要病理改變［7］。目前認(rèn)為，EMT導(dǎo)致的腎間質(zhì)細(xì)胞成纖維化和細(xì)胞外基質(zhì)沉積是RIF發(fā)生的中心環(huán)節(jié)和關(guān)鍵因素。因此認(rèn)為，RTEC損傷與RIF的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［8］。

TGF-β1是目前發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的致腎纖維化的細(xì)胞因子，具有刺激細(xì)胞外基質(zhì)積聚、誘導(dǎo)產(chǎn)生下游致纖維化因子的作用，最終加劇RIF［9］。缺氧可導(dǎo)致上皮細(xì)胞中 TGF-β1和 α-平滑肌動(dòng)蛋白（α-SMA）表達(dá)上調(diào)，出現(xiàn)Ⅳ型膠原纖維和纖維連接蛋白沉積。Matsuoka等［10］對(duì)胃癌細(xì)胞缺氧處理24 h后發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞中 TGF-β1表達(dá)明顯升高。Copple［11］對(duì)肝上皮細(xì)胞缺氧處理后發(fā)現(xiàn)，EMT相關(guān)基因（如成纖維細(xì)胞特異蛋白、α-SMA）表達(dá)升高。因此，TGF-β1可作為細(xì)胞缺氧性損傷的檢測(cè)指標(biāo)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在UUO大鼠模型中，腎臟組織TGF-β1表達(dá)明顯升高，梗阻時(shí)間越長(zhǎng)，TGF-β1表達(dá)越高，腎臟損傷越嚴(yán)重［12］。本研究結(jié)果顯示，缺氧模型組、RGZ組和GW9662組RTEC出現(xiàn)細(xì)胞萎縮，細(xì)胞壁塌陷，細(xì)胞間隙變寬，細(xì)胞損傷程度較正常對(duì)照組重;TGF-β1的蛋白表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組，提示本研究模型制備成功。

PPARγ在脂肪組織、肝臟、腎臟、血管上皮等組織廣泛分布并參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ激動(dòng)劑有保護(hù)腎臟及其細(xì)胞損傷的作用。如Lin等［13］報(bào)道，激動(dòng)PPARγ可抑制高糖誘導(dǎo)的大麻素1受體高表達(dá)，減輕腎小球系膜炎癥反應(yīng)和纖維化;Wei等［14］研究發(fā)現(xiàn)，在 TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠RTEC 轉(zhuǎn)分化模型中，RGZ 可抑制 TGF-β1、α-SMA的表達(dá)，抑制轉(zhuǎn)分化。這些均提示PPARγ信號(hào)通路參與抑制纖維化的過(guò)程。本研究結(jié)果顯示，在缺氧性RTEC損傷中，PPARγ蛋白表達(dá)明顯降低，TGF-β1蛋白表達(dá)明顯升高，PPARγ的蛋白表達(dá)與TGF-β1的蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示PPARγ蛋白的低表達(dá)可能參與了缺氧性RTEC損傷;在受體激動(dòng)劑RGZ干預(yù)之后，RGZ組RTEC損傷較缺氧模型組明顯減輕，PPARγ蛋白的表達(dá)水平較缺氧模型組明顯增高，TGF-β1蛋白表達(dá)水平明顯降低，提示RGZ可能通過(guò)上調(diào)PPARγ蛋白的表達(dá)起到減輕RTEC損傷的作用;GW9662是高選擇性的PPARγ抑制劑，本研究GW9662組RTEC損傷較缺氧模型組明顯加重，PPARγ蛋白的表達(dá)水平較缺氧模型組明顯降低，TGF-β1蛋白的表達(dá)水平明顯增高，提示GW9662可能通過(guò)下調(diào)PPARγ蛋白的表達(dá)而加重RTEC損傷。

綜上所述，在缺氧性RTEC損傷中，PPARγ蛋白的低表達(dá)可能參與了RTEC損傷;RGZ可能通過(guò)上調(diào)PPARγ蛋白的表達(dá)而減輕RTEC損傷。

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