周秋菊，彭劍濤*，趙大芹，李桂蓮

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025;2.貴州省園藝研究所，貴州 貴陽 550006;3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，貴州 貴陽 550006)

植物為抵抗低溫環(huán)境，在生長習(xí)性、生理生化、遺傳表達(dá)等方面會(huì)形成各種特殊的適應(yīng)特性，包括活性氧清除能力的提高、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累以及膜脂組分的改變，等等［1-2］。結(jié)球白菜(Brassica campestris L.ssp.pekinensis)是我國原產(chǎn)蔬菜，栽培歷史悠久，品種資源豐富，在蔬菜生產(chǎn)中占有重要地位［3］。大白菜越冬和早春生產(chǎn)過程中經(jīng)常遭遇低溫危害，影響其生長、光合、碳氮代謝、酶活性以及干物質(zhì)的積累。低溫脅迫可導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)活性氧傷害，進(jìn)而引起膜脂過氧化以及正常代謝受阻。因而，植物的抗寒性與其抗氧化能力密切相關(guān)［1］。本文通過研究零上低溫冷誘導(dǎo)和零下自然低溫脅迫條件對(duì)不同抽薹特性結(jié)球白菜品種活性氧清除系統(tǒng)的影響，探討抗氧化系統(tǒng)在結(jié)球白菜抗寒性獲得中的作用，為抗逆生理育種以及冬、春蔬菜栽培提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)和材料

試驗(yàn)在貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，供試品種為黔白5號(hào)、津青50和金黔小將。黔白5號(hào)是貴州省園藝研究所新育成的抗寒、耐抽薹品種，適合冬春、早春及春夏反季節(jié)栽培［4］。津青50和金黔小將分別為中等抽薹和易抽薹品種。試驗(yàn)材料均由貴州省園藝研究所提供。

1.2 試驗(yàn)處理

1.2.1 人工氣候箱冷誘導(dǎo)處理 將種子播種到72穴育苗盤中，以泥炭、蛭石和珍珠巖的混合物為基質(zhì)，在人工氣候箱中于20±1℃下育苗。當(dāng)幼苗長至6片真葉時(shí)，轉(zhuǎn)到4±1℃冷誘導(dǎo)處理10天后取樣進(jìn)行生理指標(biāo)測定。試驗(yàn)期間光周期為光照12h，光強(qiáng)15000Lx;黑暗12h。相對(duì)濕度約65%。處理設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.2 自然低溫脅迫(盆栽試驗(yàn))2012年10月下旬將4片真葉的幼苗移栽到直徑25cm的花盆中，土壤為菜園土，于室外盆栽場按常規(guī)栽培方式管理，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，均設(shè)置3次重復(fù)。2013年1月上旬經(jīng)歷凝凍天氣(最低溫度-6℃)后取樣測定生理指標(biāo)。

1.3 生理指標(biāo)測定

丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸顯色法［5］，超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍(lán)四唑(NBT)法［6］，過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚比色法［6］，過氧化氫酶(CAT)活性測定采用紫外分光光度法［7］，抗壞血酸(AsA)含量的測定采用二甲苯萃取比色法［8］。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，利用dps v7.05軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用LSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫對(duì)結(jié)球白菜MDA含量的影響

丙二醛是細(xì)胞膜脂過氧化產(chǎn)物，與逆境條件下細(xì)胞膜受傷害程度關(guān)系密切。由表1可見，無論是經(jīng)零上低溫冷誘導(dǎo)還是經(jīng)過冰凍傷害，3個(gè)品種結(jié)球白菜葉片中的MDA含量均以最低。冷誘導(dǎo)處理后葉片MDA含量差異顯著，最高的金黔小將比最低的黔白5號(hào)MDA含量高27.5%。經(jīng)零下低溫脅迫后，各品種葉片MDA含量均上升，其中津青50最高，金黔小將次之，但品種間差異不顯著。結(jié)果表明，黔白5號(hào)在低溫下膜系統(tǒng)損傷程度最低。

表1 結(jié)球白菜葉片丙二醛含量Tab.1 The MDA content of Chinese cabbage leaves

2.2 低溫對(duì)結(jié)球白菜AsA含量的影響

抗壞血酸是植物體內(nèi)活性氧非酶促清除系統(tǒng)的重要成員。由圖1可見，經(jīng)低溫冷誘導(dǎo)后不同抽薹特性結(jié)球白菜品種葉片抗壞血酸的含量存在顯著差異，其中黔白5號(hào)最高，金黔小將最低，高低相差2.13倍。經(jīng)零下低溫脅迫后，葉片AsA含量則是津青50的含量最高，黔白5號(hào)次之，金黔小將最低，且均低于冷誘導(dǎo)后葉片中的AsA含量。

圖1 結(jié)球白菜葉片AsA含量Fig.1 The AsA content of Chinese cabbage leaves

2.3 低溫對(duì)結(jié)球白菜SOD活性的影響

超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)清除超氧自由基的關(guān)鍵保護(hù)酶。由圖2可見，冷誘導(dǎo)后黔白5號(hào)葉片SOD活性最高，金黔小將最低，但品種間差異不顯著。經(jīng)冰凍脅迫后葉片SOD活性升高，其中黔白5號(hào)增幅最大，增加了85.2%。

2.4 低溫對(duì)結(jié)球白菜POD活性的影響

過氧化物酶(POD)也是植物體內(nèi)清除活性氧的重要抗氧化酶之一。由圖3可見，冷誘導(dǎo)后3個(gè)品種結(jié)球白菜葉片POD活性以黔白5號(hào)最大，津青50最小，但津青50與金黔小將之間差異不顯著。經(jīng)零下低溫脅迫后各品種POD活性均降低，其中津青50降幅最大，達(dá)到31.1%;其余2個(gè)品種POD活性下降不顯著。

圖2 結(jié)球白菜葉片SOD活性Fig.2 The SOD activity of Chinese cabbage leaves

圖3 結(jié)球白菜葉片POD活性Fig.3 The POD activity of Chinese cabbage leaves

2.5 低溫對(duì)結(jié)球白菜CAT活性的影響

過氧化氫酶(CAT)是植物體內(nèi)清除H2O2的主要酶類之一。由表2可見，冷誘導(dǎo)處理的黔白5號(hào)葉片CAT活性最高，津青50最低，二者相差2.01倍。經(jīng)零下低溫脅迫后，3個(gè)品種結(jié)球白菜葉片CAT活性均顯著增大，其中金黔小將最高，增幅為87.6%;津青50葉片CAT活性雖然仍是3個(gè)品種中最低的，但其上升幅度卻最大，達(dá)到103.9%。

表2 結(jié)球白菜葉片CAT活性Tab.2 The CAT activity of Chinese cabbage leaves

3 討論

正常情況下，植物細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除之間保持動(dòng)態(tài)平衡，自由基維持較低水平，不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成傷害。這種平衡在低溫逆境條件下會(huì)被打破，導(dǎo)致植物體代謝過程產(chǎn)生的自由基積累過多，進(jìn)而對(duì)植物膜系統(tǒng)有傷害作用［9］。植物體內(nèi)的酶促與非酶促活性氧清除系統(tǒng)可減輕自由基造成的傷害減輕傷害，其中酶促系統(tǒng)主要包括SOD、POD和CAT等，非酶促系統(tǒng)的抗氧化劑則包括抗壞血酸和谷胱甘肽等［10］。相關(guān)分析表明，SOD、POD、CAT活性和抗壞血酸含量均能較好地反映植物抗逆能力［11］。

研究表明，1～5℃低溫冷誘導(dǎo)可顯著提高擬南芥抗凍性，使其冰凍致死溫度降低到 -12℃［12］。本試驗(yàn)采用4℃低溫對(duì)供試材料進(jìn)行冷馴化，結(jié)果表明黔白5號(hào)抗壞血酸含量顯著高于其他2個(gè)品種?？箟难峒瓤勺鳛槌跫?jí)抗氧化物直接清除單線態(tài)氧、超氧自由基和羥基自由基，又可作為酶的底物在活性氧清除過程中扮演重要角色。較高的AsA含量意味著黔白5號(hào)在冰凍條件下自由基清除能力更高，恢復(fù)能力更強(qiáng)。冷誘導(dǎo)后黔白5號(hào)葉片SOD、POD和CAT活性在3個(gè)品種中最高，而膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量最低，這些結(jié)果均說明其活性氧清除能力最強(qiáng)，抗凍能力優(yōu)于其他品種。

經(jīng)零下低溫脅迫后，結(jié)球白菜葉片AsA含量和POD活性均下降，SOD和 CAT活性則上升。AsA含量可能是由于低溫下活性氧水平提高，抗壞血酸-谷胱甘肽系統(tǒng)還原消耗增加所致。過氧化物酶POD是一種以鐵卟啉為輔基的酶類，其消除H2O2需要從抗壞血酸和谷胱甘肽等底物中獲得電子后傳遞給過氧化氫［10］，因此在低溫下其活性的降低與AsA含量下降是一致的。CAT則是直接清除過氧化氫，作用方式與POD不同，二者具有一定的互補(bǔ)作用。黔白5號(hào)葉片SOD活性在零下低溫條件下顯著提高，其他2個(gè)品種則變化不顯著，表明黔白5號(hào)受低溫脅迫后超氧自由基清除能力持續(xù)上升，有利于增強(qiáng)植株抗凍性。

綜上所述，在低溫脅迫下，黔白5號(hào)葉片抗壞血酸含量以及SOD、POD、CAT活性值均高于其他2個(gè)品種，膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量最低，表明其在低溫脅迫下活性氧清除系統(tǒng)能力較強(qiáng)，能有效地清除氧自由基對(duì)植物造成的傷害，表現(xiàn)出較強(qiáng)的低溫逆境抗性。試驗(yàn)結(jié)果也表明，結(jié)球白菜抗氧化系統(tǒng)與抽薹特性之間存在一定關(guān)系，耐抽薹品種活性氧清除能力強(qiáng)于中等抽薹和不耐抽薹品種，而后兩者之間則互有高低。

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