饒進軍，何關生，毛楠，呂琳，臘蕾（.南方醫(yī)科大學藥學院，廣州5055；.廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院藥學部，廣州 5060；.廣州市番禺中心醫(yī)院藥學部，廣州 5400；4.南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院藥學部，廣州 5055）

小細胞肺癌（Small cell lung cancer，SCLC）屬肺癌的一種未分化型，發(fā)病率約占肺癌的15%～20%，具有分裂指數高、倍增時間短、侵襲能力強等特點；確診時大多已出現遠處轉移，失去手術治療機會[1]。鉑類聯合依托泊苷是當前治療SCLC的一線方案，但由于對藥物的耐受以及腫瘤細胞的高轉移率，臨床治療效果很不滿意，患者的平均生存期僅有15～20個月[1]。Bmi-1屬多梳基因（Polycomb group genes，PcG）家族，具有遏制抑癌基因表達（如INK4a/ARF）、誘導細胞惡性轉化、維護腫瘤干細胞更新及促進癌細胞侵襲轉移等作用，被認為是腫瘤惡性標記之一[2]，是一個潛在的抗腫瘤新靶點，目前已被試用于多種腫瘤[3-4]。近來研究發(fā)現，98.4%的SCLC病例Bmi-1呈現過表達，顯示Bmi-1在SCLC細胞的生長繁殖中有重要作用[5]，但對于Bmi-1能否作為治療SCLC的靶點，目前尚未見報道。本研究擬以人SCLC細胞H1963作為研究對象，通過小分子干擾RNA（siRNA）轉染Bmi-1得到沉默Bmi-1基因，研究沉默Bmi-1基因對H1963細胞增殖與侵襲的抑制作用，以期為SCLC的治療提供新思路和新方法。

1 材料

1.1 儀器

倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；5810R型高速離心機（德國Eppendorf公司）；M680型酶標儀、蛋白質印跡法（Western Blot）印跡轉移電泳儀系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；FACS Calibur型流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 藥品與試劑

F12K培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）；siRNA（廣州銳博生物科技有限公司，純度：99.9%）；陽離子脂質體Lipofectamine RNA imax（美國 Invitrogen公司）；MTT（美國Sigma公司）；細胞周期檢測試劑盒（武漢碧云天生物技術研究所）；Matrigel基質膠（美國BD公司）；兔抗人Bmi-1、抑癌基因（P16、P14）和上皮型鈣黏蛋白（E-cadherin）、神經型鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質金屬蛋白酶組織抑制因子1（TIMP-1）、β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（IgG-HRP）二抗（美國CST公司）；增強化學發(fā)光（ECL）試劑盒（美國Milipore公司）；其余試劑均為國產分析純。

1.3 細胞

H1963細胞株購自中國科學院上海細胞庫。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)與siRNA干擾

H1963細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基中，取對數生長期細胞經胰酶消化，按每孔1.5×105個接種于6孔板，每孔5×103個接種于96孔板。siRNA轉染Bmi-1基因序列為5′-GGGAAAGUGUAUGAUAAAUTT-3′、陰性對照序列Neg-siRNA為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，以《廣州銳博生物科技有限公司siRNA產品說明》推薦的siRNA劑量（100 nmol/L），按照lipofectamine RNA imax操作說明書進行轉染。

2.2 Western blot法檢測siRNA對H1963細胞Bmi-1的基因沉默效果

取“2.1”項接種于6孔板的細胞，隨機分組，每組3個復孔，即試驗組（100 nmol/L特異性Bmi-1的siRNA轉染）、陰性對照組（100 nmol/L Neg-siRNA轉染）和空白對照組。細胞轉染48 h后分別提取細胞總蛋白，以二喹啉甲酸（BCA）法測定濃度。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離總蛋白后，半干法轉印至PVDF膜上，于含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中室溫封閉1 h，以1∶1000稀釋比例的一抗4℃孵育過夜。TBST緩沖液洗滌5 min×3次后用1∶2 000稀釋的IgG-HRP二抗室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜5 min×3次，ECL顯色后，X光膠片曝光成像。將膠片進行掃描，蛋白表達強度用目的蛋白條帶的灰度和內參β-actin蛋白條帶灰度的比值表示，蛋白條帶灰度采用Gel-Pro analyzer 4.0軟件進行分析。

2.3 MTT法檢測沉默Bmi-1基因對細胞增殖能力的影響

取“2.1”項接種于96孔板的細胞，隨機分組同“2.2”項，每組6個復孔。各組細胞在轉染后1、2、3、4、5 d分別每孔加MTT（5 mg/ml）10 μl，4 h吸出孔內液體，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μl，震蕩10 min后檢測570 nm波長下的光密度（OD）值，并按公式計算抑制率（%）＝（1－給藥組平均OD值/空白對照組平均OD值）×100%。

2.4 流式細胞儀檢測沉默Bmi-1基因對細胞周期分布的影響

取“2.1”項接種于6孔板的細胞，隨機分組同“2.2”項，每組3個復孔。各組細胞轉染48 h后，收集細胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，調整細胞濃度為2×105L－1后用70%乙醇4℃保存過夜，PBS洗去固定液后，加入500 μl碘化丙啶染色液，37℃避光30 min，流式細胞儀檢測細胞周期分布情況。

2.5 Transwell侵襲試驗檢測沉默Bmi-1基因對細胞侵襲能力的影響

取“2.1”項接種于6孔板的細胞，隨機分組同“2.2”項，每組3個復孔。各組細胞轉染48 h后胰酶消化成單個細胞，無血清的F12K培養(yǎng)基洗2次，調整細胞濃度為3×105ml－1。將Matrigel膠（預先以DMEM培養(yǎng)基按1∶8稀釋）按每孔50 μl均勻鋪于Transwell小室中，在上室加入100 μl細胞懸液，在下室加入600 μl含10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，取出上室用棉簽將未遷移過去的上室內表面的細胞輕輕拭去，甲醇固定細胞，結晶紫染色，倒置顯微鏡下取5個視野（×200）計數穿膜細胞平均值。

2.6 Western Blot法檢測沉默Bmi-1基因對P16、P14、E-cadhe-rin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、TIMP-1蛋白表達的影響

取“2.1”項接種于6孔板的細胞，隨機分組同“2.2”項，每組3個復孔。各組細胞轉染48 h后提取總蛋白，按“2.2”項下方法檢測抑癌基因（P16、P14）和侵襲相關蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、TIMP-1）表達。

2.7 統(tǒng)計學處理

3 結果

3.1 細胞Bmi-1的基因沉默效果

轉染48 h后，與空白對照組和陰性對照組比較，試驗組H1963細胞中Bmi-1蛋白表達量下調80%，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明siRNA能有效沉默細胞中的Bmi-1基因表達。各組細胞中Bmi-1蛋白表達的電泳圖見圖1。

3.2 細胞增殖情況

與陰性對照組比較，試驗組細胞在轉染3、4、5 d時的增殖抑制率明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），其中3 d時增殖抑制率最高[增殖抑制率為（63.61±6.97）%，P＜0.01]，表明沉默Bmi-1基因可顯著抑制H1963細胞的增殖。各組細胞的增殖抑制率比較見圖2。

圖1 各組細胞中Bmi-1蛋白表達的電泳圖Fig 1 Electrophoretogram of protein expression of Bmi-1 in each group

圖2 各組細胞的增殖抑制率比較Fig 2 Comparison of the inhibitory effect of cell in each group

3.3 細胞周期分布情況

與空白對照組和陰性對照組比較，試驗組細胞在G0/G1期的比例明顯增加（P＜0.05），S期、G2/M期的比例明顯減少（P＜0.05），表明沉默Bmi-1基因可使H1963細胞發(fā)生G1/S期阻滯。各組細胞的周期分布見表1。

表1 各組細胞的周期分布（±s，n＝3）Tab 1 Distribution of cell cycle in each group（±s，n＝3）

表1 各組細胞的周期分布（±s，n＝3）Tab 1 Distribution of cell cycle in each group（±s，n＝3）

與空白對照組和陰性對照組比較：＊P＜0.05vs.blank control group and negative control group：＊P＜0.05

組別空白對照組陰性對照組試驗組細胞比例，%G2/M 24.97±0.75 25.56±1.01 14.36±1.09＊G0/G1 48.69±0.83 46.77±0.95 69.72±1.25＊S 26.34±0.91 27.71±0.84 15.92±0.89＊

3.4 細胞侵襲能力變化

空白對照組、陰性對照組和試驗組穿透基底膜的細胞數分別為（222±51）、（204±44）、（53±17）個，試驗組侵襲細胞數明顯低于空白對照組和陰性對照組（P＜0.01），表明沉默Bmi-1基因可使細胞侵襲能力顯著降低。各組細胞穿透基底膜的顯微鏡圖見圖3。

3.5 細胞抑癌基因P16、P14的表達情況

與空白對照組和陰性對照組比較，試驗組細胞的P16、P14蛋白表達分別升高180%、320%，表明沉默Bmi-1基因可顯著上調抑癌基因P16、P14表達。各組細胞中P16、P14蛋白表達的電泳圖見圖4。

3.6 細胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、TIMP-1蛋白的表達情況

與空白對照組和陰性對照組比較，試驗組細胞的E-cadherin、TIMP-1蛋白表達量分別上調110%、210%，N-cadherin、Vimentin、MMP-2蛋白表達量分別下調70%、40%、80%，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明沉默Bmi-1基因可顯著影響細胞侵襲能力的相關蛋白表達，電泳圖見圖5。

圖3 各組細胞穿透基底膜的顯微鏡圖（×200）Fig 3 Micrograph of cells penetrating the basement membrane in each grou（p×200）

圖4 各組細胞中P16、P14蛋白表達的電泳圖Fig 4 Electrophoretogram of protein expression of P16 and P14 in each group

圖5 各組細胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、TIMP-1蛋白表達的電泳圖Fig 5 Electrophoretogram of protein expression of E-cadherin，N-cadherin，Vimentin，MMP-2 and TIMP-1 in each group

4 討論

當前關于肺癌的藥學研究大多聚焦于非小細胞肺癌，而研究SCLC的很少。固然SCLC發(fā)病率遠低于非小細胞肺癌，但由于其增殖快、侵襲力強、致死率極高，且近年來有逐漸增多的趨勢，因此已成為嚴重危害人類生命的一類惡性腫瘤。鑒于現有的治療方案效果都很不理想，尋找新的作用靶點就成為治療SCLC的關鍵。

本研究結果顯示，沉默Bmi-1基因能顯著抑制H1963細胞的增殖，表明Bmi-1有望成為治療SCLC的一個新靶點。Bmi-1作為Polycomb抑制復合物1（PRC1）的核心亞基，與Ring1B協同催化組蛋白H2A-K119泛素化，使得染色質處于收緊狀態(tài)，抑制轉錄因子對DNA的作用，同時還抑制轉錄的延伸過程[4]，最終導致基因表達的抑制。重要的抑癌基因INK4a/ARF就是Bmi-1主要的靶基因[6]。INK4a/ARF基因編碼P16、P14抑癌蛋白，是維持細胞周期平衡、調節(jié)細胞增殖與衰老的關鍵基因[7]，一旦該基因受抑或缺失會使細胞發(fā)生惡性轉化[8]。本研究發(fā)現，沉默Bmi-1基因可使P14、P16表達升高和細胞周期的G1/S期阻滯，說明干擾Bmi-1后產生的抑癌作用與其激活INK4a/ARF、阻滯細胞周期有關，不過是否還通過其他環(huán)節(jié)產生抑癌作用，則尚待進一步考證。

Bmi-1不僅參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，還參與腫瘤的侵襲轉移[9-10]。Bmi-1對Snail、Twist、ZEB1具有穩(wěn)定、激活和協同作用，并由此誘導細胞發(fā)生上皮-間充質轉化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT），增強細胞遷移侵襲能力。

近來研究發(fā)現，沉默Bmi-1基因能逆轉鼻咽癌、頭頸鱗狀細胞癌的EMT，減少其侵襲轉移[11-12]。本研究通過Transwell小室試驗發(fā)現沉默Bmi-1對H1963細胞有明顯的抗侵襲轉移作用，這一結果更進一步提升了Bmi-1抗SCLC的應用價值。

根據經典的斯蒂芬·佩吉特“種子-土壤”理論，腫瘤轉移過程大體是：具有轉移能力的癌細胞（種子）從原病灶脫離——遠處遷移——侵襲組織器官（土壤）——生長繁殖、轉移瘤塊生成等。這過程涉及細胞的黏附、遷移、侵蝕等幾個環(huán)節(jié)，結合試驗結果，提示沉默Bmi-1基因可從多環(huán)節(jié)產生抗侵襲轉移作用：（1）誘導E-cadherin表達，這可使細胞間的黏附增強，抑制細胞的脫落分離；（2）抑制Vimentin、N-cadherin，這可降低細胞運動能力，抑制細胞遷移運動；（3）MMP-2表達減弱，TIMP-1表達增強，這可使細胞侵蝕能力減弱，從而使在“土壤”上種植機會減少。由此，沉默Bmi-1基因可遏制SCLC的轉移。

本研究證明了抑制Bmi-1的表達可有效抑制SCLC的增殖及轉移，這為以Bmi-1為靶點的新藥開發(fā)提供了一定的理論與實驗依據。

[1]Jackman DM，Johnson BE.Small-cell lung cancer[J].Lancet，2005，366（9 494）：1 385.

[2]Cao L，Bombard J，Cintron K，et al.Bmi-1 as a novel target for drug discovery in cancer[J].J Cell Biochem，2011，112（10）：2 729.

[3]Yao XB，Wang XX，Liu H，et al.Silencing Bmi-1 expression by RNA interference suppresses the growth of laryngeal carcinoma cells[J].Int J Mol Med，2013，31（5）：1 262.

[4]Gao FL，Li WS，Liu CL，et al.Silencing Bmi-1 enhances the senescence and decreases the metastasis of human gastric cancer cells[J].World J Gastroenterol，2013，19（46）：8 764.

[5]Koch LK，Zhou H，Ellinger J，et al.Stem cell marker expression in small cell lung cacinoma and developing lung tissue[J].Hum Pathol，2008，39（11）：1 597.

[6]Eckert RL，Adhikary G，Rorke EA，et al.Polycomb group proteins are key regulators of keratinocyte function[J].Invest Dermatol，2011，131（2）：295.

[7]Wang Y，Guan Y，Wang F，et al.Bmi-1 regulates self-renewal，proliferation and senescence of human fetal neural stem cells in vitro[J].Neurosci Lett，2010，476（2）：74.

[8]Sharpless NE.INK4 a/ARF：a multifun tional tumor suppressor locus[J].Mutat Res，2005，576（1/2）：22.

[9]Gavrilescu MM，Todosi AM，Ani?ei MG，et al.Expression of bmi-1 protein in cervical，breast and ovarian cancer[J].Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi，2012，116（4）：1 112.

[10]Kreso A，van Galen P，Pedley NM，et al.Self-renewal as a therapeutic target in human colorectal cancer[J].Nat Med，2014，20（1）：29.

[11]Song LB，Li J，Liao WT，et al.The polycomb group protein bmi-1 represses the tumor suppressor PTEN and induces epithelial-mesenchy mal transition in human nasopharyngeal epithelial cells[J].Clin Invest，2009，119（12）：3 626.

[12]Yu CC，Lo WL，Chen YW，et al.Bmi-1 regulates snail expression and promotes metastasis ability in head and neck squamous cancer-derived ALDH1 positive cells[J].J Oncol，2011，doi：10.1155/2011/609259.