李福智 侯 陽 李曉明 房 艷 臧東鈺 (遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院胸外科，遼寧 錦州 000)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)具有兩個(gè)特性，一是所有干細(xì)胞具有自我更新的能力，即干細(xì)胞可以通過對(duì)稱分裂，形成兩個(gè)相同的干細(xì)胞以維持自身細(xì)胞群的數(shù)目;二是干細(xì)胞都具有分化能力，干細(xì)胞可以通過非對(duì)稱的分裂方式分裂，產(chǎn)生子代細(xì)胞并保持親代的特性。BMSCs移植為臨床各系統(tǒng)疾病損傷修復(fù)治療和細(xì)胞替代治療提供一種新的手段〔1，2〕。選用BMSCs，不僅可以用于缺失細(xì)胞的修補(bǔ)治療，也是有效的基因片段載體。Lou 等〔3〕及 Yoo等〔4〕的研究表明，BMSCs基因轉(zhuǎn)染率較高，經(jīng)轉(zhuǎn)染后到達(dá)不同區(qū)域可分化為相應(yīng)的組織，因而可以作為一個(gè)有效的載體進(jìn)行基因治療。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和主要試劑 4～6周齡的雄性SD大鼠4～6只，體重(110±10)g，由遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。真核表達(dá)載體pEGFP-N1為遼寧醫(yī)學(xué)院解剖教研室提供。FUGENE HD轉(zhuǎn)染試劑為Ebiotrade公司生產(chǎn)(批號(hào)1118843)、L-DMEM培養(yǎng)基購置 HyClone公司(批號(hào) NWF0426)、乙二胺四乙酸(EDTA)購置 Sigma公司(批號(hào)E6758)、胎牛血清(FBS)購置Thermo Fisher北京公司(批號(hào)NVA0227)、兔抗大鼠單克隆抗體CD 44、CD 45購置美國 BD公司(批號(hào)分別是55751，55752)。

1.2 BMSCs的培養(yǎng)及鑒定 采用貼壁篩選法〔5〕和密度梯度離心法〔6〕聯(lián)合操作獲取BMSCs:取4周齡SD大鼠2只，拉頸處死后，酒精浸泡消毒，剪除骨的兩端，用注射器吸取DMEM/F12培養(yǎng)基并含15%FBS 5 ml沖洗每根股骨。進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按1×107細(xì)胞/cm2接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。基于細(xì)胞增殖和細(xì)胞密度融合時(shí)用含0.25% 胰蛋白酶0.02%EDTA的液消化后按1∶3的比例每3天進(jìn)行分瓶。免疫組化檢測滴加一抗為兔抗大鼠單克隆抗體 CD44、CD45，實(shí)驗(yàn)結(jié)果獲得純度較高BMSCs。CD44表達(dá)陽性，而CD 45表達(dá)陰性，證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為BMSCs。

1.3 FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑將重組表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到BMCSs細(xì)胞內(nèi) 將P2～P3代細(xì)胞置于6孔板;將 HD轉(zhuǎn)染試劑-質(zhì)粒DNA混合物中，調(diào)節(jié)濃度為500 μg/ml的G418培養(yǎng)液進(jìn)行篩選:選擇出在10～14 d內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的最低G 418濃度進(jìn)行下一步的篩選試驗(yàn)(本次篩選濃度為500 μg/ml)。同時(shí)用未加轉(zhuǎn)染液的細(xì)胞做對(duì)照。當(dāng)對(duì)照細(xì)胞大部分死亡時(shí)(3～5 d后)，再換一次篩選液，G418濃度可降至150～250 μg/ml維持篩選作用。10～20 d后，可見有抗性克隆形成，待其逐漸增大后，將其逐一移至24孔板繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 蛋白印記檢測Ang-1在BMSCs中的表達(dá) 收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的BMSCs和未轉(zhuǎn)染的BMSCs(密度為2×106個(gè)/ml)離心，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗。加入細(xì)胞裂解液60～100 μl，短暫振蕩，冰上作用30 min，12 000 r/min離心5 min。聚遍氯乙烯(PVDF)膜在含有50 g/L脫脂奶粉的Tris鹽酸緩沖液(TTBS)中37℃封閉90 min，依次加入一抗(抗鼠Ang-1抗體，抗體稀釋濃度為1∶1 000)，4℃孵育過夜，二抗(辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗人IgG，抗體稀釋濃度為1∶1 000)顯色，觀察結(jié)果。進(jìn)行凝膠圖像分析。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的形態(tài)學(xué)及免疫組織化學(xué)鑒定 在倒置顯微鏡下觀察接種時(shí)漂浮的單個(gè)核細(xì)胞呈圓形，在顯微鏡下觀察具有很強(qiáng)的折光性。在4～5 d貼壁的BMSCs呈短梭形或不規(guī)則形，傳至3代以后細(xì)胞逐漸變?yōu)殚L梭形，雜質(zhì)細(xì)胞較少，細(xì)胞排列呈明顯的旋渦狀在瓶底清晰可見。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示幾乎所有BMSCs細(xì)胞CD 44表達(dá)陽性，而CD 45表達(dá)陰性，證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為BMSCs。見圖1，圖2。

2.2 Western印跡檢測BMSCs內(nèi)重組蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染Ang-1的BMSCs有相應(yīng)的Ang-1蛋白表達(dá);未轉(zhuǎn)染的BMSCs未見Ang-1蛋白表達(dá)。見圖3。

2.3 轉(zhuǎn)染后BMSCs細(xì)胞的形態(tài)學(xué)結(jié)果 成功將pEGFP/Ang-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BMCSs，在熒光顯微鏡下觀察;1 d綠色熒光不明顯，3 d熒光最為明顯。見圖4。

圖1 光鏡下觀察傳至第3代的BMSCs(×200)

圖2 免疫組化染色檢測CD44(×200)

圖3 Western印跡鑒定重組融合蛋白的表達(dá)

圖4 轉(zhuǎn)染pEGFP/Ang-1質(zhì)粒后熒光顯微鏡下形態(tài)(×100)

3 討論

BMSCs具有干細(xì)胞的共性，即具有自我復(fù)制和多向分化能力，在不同條件下可以分化所有中胚層來源的組織，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等〔7～10〕。根據(jù)細(xì)胞的大小和密度常可分離具有不同生物學(xué)特征的各種細(xì)胞亞群。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)條件摸索幾種簡便的方法，獲得純化效果較好。貼壁法:最常用的分離培養(yǎng)方法，除非有些特殊的細(xì)胞要求是懸浮培養(yǎng)，大部分細(xì)胞都適用于貼壁法。密度梯度離心法:常用Ficoll直接作為分離介質(zhì)來分離細(xì)胞，但是高濃度Ficoll黏度較大，分離效果還很不理想，加入Hypaque可使分離液黏度降低，以提高分離效率。免疫選擇法:Phinney〔11〕采用一種免疫消耗技術(shù)，精確地將目的細(xì)胞造血細(xì)胞系和內(nèi)皮細(xì)胞系從基質(zhì)細(xì)胞中成功的分離出來。流式細(xì)胞儀分選法:此技術(shù)較為復(fù)雜，儀器昂貴，需專業(yè)技術(shù)人員進(jìn)行操作，操作費(fèi)時(shí)。本文在反復(fù)取材和多次培養(yǎng)BMCSs采用貼壁法和密度梯度離心法兩種方法相結(jié)合，細(xì)胞在傳至第一代時(shí)純度較高，傳第三代時(shí)純度可以達(dá)到95%。在鏡下觀察細(xì)胞變?yōu)榧忓N形，細(xì)胞排列呈明顯的輻射狀或旋渦狀，此時(shí)細(xì)胞狀態(tài)最好，經(jīng)多次傳代換液，細(xì)胞輪廓清楚，折光性強(qiáng)，生長迅速，少量集落排列呈漩渦狀。此時(shí)細(xì)胞處于有絲分裂中期更容易表達(dá)脂質(zhì)體導(dǎo)入。接下來就是將含綠色熒光蛋白(GFP)的pEGFP-N1作為報(bào)告基因，證實(shí)目的基因在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)、高效、穩(wěn)定地表達(dá)。在基因治療的載體有病毒載體和質(zhì)粒載體被廣泛應(yīng)用，脂質(zhì)體作為基因轉(zhuǎn)移的載體具有低毒、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，而且具有一定的轉(zhuǎn)染效率〔12〕，該轉(zhuǎn)染技術(shù)近年來發(fā)展較快，試劑商品化和安全性好，因而目前廣泛應(yīng)用于細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染。在基因治療中將外源基因?qū)敫杉?xì)胞使其穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞核表達(dá)是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵，基因治療的最大優(yōu)點(diǎn)是通過機(jī)體自身細(xì)胞分泌轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，避免了使用重組蛋白的昂貴費(fèi)用。需要指出的是，本實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染效率仍偏低，這可能與載體細(xì)胞的特性和轉(zhuǎn)染方法有關(guān)，應(yīng)采取措施提高轉(zhuǎn)染效率進(jìn)一步改善基因治療的效果。

1 Sensebé L，Krampera M，Schrezenmeier H，et al.Mesenchymal stem cells for clinical application〔J〕.Vox Sang，2010;98(2):93-107.

2 Uccelli A，Moretta L，Pistoia V.Mesenchymal stem cells in health and disease〔J〕.Nat Rev Immunol，2008;8(9):726-36.

3 Lou J，Xu F，Merkel K，et al.Gene therapy:adenovirus-mediated human bone morphogenetic protein-2 gene transfer induces mesenchymal progenitor cell proliferation and in vitro and differentiation bone formation in vivo.J Orthop Res，1999;17(1):43-50.

4 Yoo JU，Mandell I，Angele P，et al.Chondrogenitor cells and gene therapy〔J〕.Clin Orthop Relat Res，2000;379(Suppl):S164-70.

5 Franklin RJ，Gilson JM，F(xiàn)ranceschini IA，et al.Schwann cell-like myelination following transplantation of an olfactory bulb-ensheathing cell line into areas of demyelination in the adult CNS〔J〕.Glia，1996;17(3):217-24.

6 Majumdar MK，Thiede MA，Mosca JD，et al.Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells(MSCs)and stromal cells〔J〕.J Cell Physiol，1998;176(1):57-66.

7 Wang Y ，Volloch V，Pindrus MA，et al.Murine osteoblasts regulate mesenchymal stem cells via WNT and cadherin pathways:mechanism depends on cell-celI contact mode〔J〕.J Tissue Eng Regen Med，2007;1(1):39-50.

8 Sim WY，Park SW，Park SH，et al.A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation〔J〕.Lab Chip，2007;7(12):1775-82.

9 黃定強(qiáng)，楊大鑒，黎萬榮，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)條件下向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的關(guān)系〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2006;10(1):31-3.

10 Wang XJ，Dong Z，Zhong XH，et al.Transforming growth factor-beta1 enhanced vascular endothelial growth factor synthesis in mesenchymal stem cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2008;365(3):548-54.

11 Phinney DG.lsolation of mesenchymal stem cells from murine bone marrow by immunodepletion〔J〕.MethodsMol Biol，2008;449:171-86.

12 Hammes HP，Lin J，Wagner P，et al.Angiopoietin-2 causes pericyte dropout in the normal retina:evidence for involvement in diabetic retinopathy〔J〕.Diabetes，2004;53(4):1104-10.