周輝吳 煒趙明

細胞分裂周期蛋白2(cell division cycle 2,Cdc2)又叫細胞周期蛋白依賴性激酶1（cyclin-dependent kinases1,CDK1），是一個高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。在整個細胞周期調(diào)控中特別是G2至M期起關(guān)鍵作用。G2后期Cdc2激酶與積累的周期蛋白B(cyclin B)結(jié)合形成Cdc2-cyclinB復合物，也稱有絲分裂促進因子(MPF)，推進細胞周期進入有絲分裂M期[1-2]。Cdc2激酶的過度表達，可使細胞周期進程紊亂，以致細胞不能正常生長、分化，導致細胞惡性增殖，形成腫瘤[3]。本實驗通過構(gòu)建Cdc2基因啟動子熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒，并在骨肉瘤細胞U2OS中驗證其啟動子轉(zhuǎn)錄活性，旨在利用該報告基因來篩選新的抗腫瘤藥物，并為研究臨床抗腫瘤藥物的分子生物學機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 U2OS細胞株購自中科院上海細胞庫。大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α、載體質(zhì)粒pGL3-Basic、內(nèi)參質(zhì)粒pRL-SV40本科室保留。人血基因組DNA純化試劑盒購自天根生化科技公司。DNA片段凝膠回收試劑盒購自Axygen公司；KOD FX DNA聚合酶、Ligase high酶購自TOYOBO；限制性內(nèi)切酶ScaⅠ和XhoⅠ購自大連TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒和轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；胰蛋白酶、新生牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；瓊脂粉（Agar）、胰蛋白胨（Tryptone）、酵母浸出粉（Yeast Extract）購自英國Oxoid公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（Dual-Luciferase Reporter Assay System）購自美國Promega公司。所用儀器：PCR儀（美國Bio-Rad公司）；電泳儀（北京百晶）；凝膠圖像分析儀（法國Vilber Lourmat公司）；高速離心機（美國Beckman公司）；多孔板高效閱讀器（美國Molecular Devices公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 應(yīng)用UCSC基因組瀏覽器查找人Cdc2基因啟動子序列。根據(jù)參考文獻[4]，確定本實驗研究Cdc2基因啟動子長度為3 273 bp（-3 198 bp～+75 bp）。并用Primer 5分析啟動子序列上的限制性內(nèi)切酶位點。設(shè)計其兩端引物（PCR引物合成由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成）。上游引物：5＇-TGATGAGCTCTTTTAGAAGGAGTCTC?GCTC-3＇，包含Cdc2基因啟動子堿基，1個SacⅠ內(nèi)切酶識別位點，4個保護堿基。下游引物：5＇-TAATCTCGAGACCGC?GTCGCTCTCCGCTCA-3＇，包含Cdc2基因啟動子互補堿基，1個XhoⅠ識別位點，4個保護堿基。產(chǎn)物大小3 293 bp。

1.2.2 Cdc2啟動子的PCR擴增 取正常人外周血5 mL，按照血液基因組DNA提取試劑盒的操作方法，提取基因組DNA。以基因組DNA為模板，用KOD FX DNA聚合酶進行PCR擴增反應(yīng)；反應(yīng)條件為94℃預變性2 min，98℃變性10 s，65℃退火30 s，68℃延伸3 min 30 s，共進行35個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖膠電泳，利用凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

1.2.3 Cdc2基因啟動子報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建 采用pGL3-Basic載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化氯化鈣感受態(tài)細胞DH5α，挑單克隆進行大量擴增；用質(zhì)粒抽提試劑盒制備擴增pGL3-Basic質(zhì)粒，用紫外分光光度儀測定純度和濃度。先后用限制性內(nèi)切酶SacⅠ和XhoⅠ對回收的Cdc2啟動子PCR產(chǎn)物和pGL3-Basic載體質(zhì)粒進行雙酶切，電泳后切膠回收酶切產(chǎn)物。用Ligase high連接酶將酶切回收后的載體片段和目的DNA片段進行連接反應(yīng)，16℃孵育過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆于含有氨芐青霉素抗性的LB（Luria-Bertani）液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min，培養(yǎng)8 h后取少量進行菌液PCR，其余的液體繼續(xù)震蕩培養(yǎng)至14 h，對菌液PCR顯示陽性的菌液，用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒后，雙酶切初步鑒定重組質(zhì)粒，挑取陽性樣本測序。重組質(zhì)粒pGL3-Cdc2-pro?moter和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-SV40共轉(zhuǎn)染U2OS細胞后，測定螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶報告基因活性，并將兩者的比值作為衡量Cdc2啟動子活性的依據(jù)，pRL-SV40作為內(nèi)參可以消除由于細胞數(shù)目及轉(zhuǎn)染效率等不同所帶來的組間差異。

1.2.4 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染骨肉瘤U2OS細胞 將U2OS細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染的前1 d將U2OS細胞以1×104的密度接種于24孔板并換用無抗生素的含10%胎牛血清培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至細胞密度達到80%。按照Lipofectamine 2000試劑盒操作說明，瞬時轉(zhuǎn)染Cdc2基因啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒pGL3-Cdc2-promoter及內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-SV40。另設(shè)一組轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pGL3-Basic和內(nèi)參pRL-SV40質(zhì)粒作為對照組。

1.2.5 Cdc2啟動子活性測定 轉(zhuǎn)染24 h后，每孔細胞用PBS洗滌2次。按照Promega公司的雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（Dual-Luciferase Reporter Assay System）說明書，每孔加入100 μL的PLB（Passive Lysis Buffer）裂解細胞，于搖床上震搖15 min，收集細胞裂解液。取20 μL細胞裂解液，先用多孔板高效閱讀器讀取背景值。每孔加入100 μL的LARⅡ工作液，讀取螢火蟲熒光素酶發(fā)光值。再加入100 μL的Stopamp;GloRReagen（t螢火蟲熒光素酶終止液和海腎熒光素酶的底物），讀取海腎熒光素酶發(fā)光值。2組細胞同時檢測，每組細胞重復檢測3次。以螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值作為相對熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進行分析，計量資料以x±s表示，采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Cdc2啟動子片段的擴增 以正常人血細胞基因組DNA為模板，克隆Cdc2啟動子片段，1%瓊脂糖膠電泳可在3 000 bp附近可見單一條帶，見圖1A，與3 273 bp的Cdc2基因啟動子大小相符。

2.2 報告基因pGL3-Cdc2-promoter載體構(gòu)建 膠回收后的Cdc2啟動子片段和pGL3-Basic雙酶切后，見圖1B。連接、轉(zhuǎn)化，構(gòu)建pGL3-Cdc2-promoter重組質(zhì)粒。對菌液PCR陽性的樣品提質(zhì)粒后，再用SacⅠ和XhoⅠ進行雙酶切。酶切產(chǎn)物電泳可在3 000 bp和5 000 bp附近處出現(xiàn)2個條帶，這與插入的3 273 bp的Cdc2啟動子目的片段和4 800 bp的線性pGL3-Basic大小完全一致，見圖2。測序結(jié)果顯示，Cdc2基因啟動子成功插入到pGL3-Basic載體中，見圖3，且未發(fā)現(xiàn)堿基突變。

Figure 1 Electrophoresis of Cdc2 promoter PCR product and digestion of pGL3-Basic plasmids by endonucleases圖1 Cdc2啟動子片段的PCR及pGL3-Basic雙酶切電泳圖

2.3 重組質(zhì)粒的功能鑒定 檢測到瞬時共轉(zhuǎn)染pGL3-Cdc2-promoter/pRL-SV40組熒光素酶活性為1.591 5±0.199 8，高于轉(zhuǎn)染pGL3-Basic/pRL-SV40組的熒光素酶活性0.049 9±0.010 4，差異有統(tǒng)計學意義(t=13.346，P＜0.01)。

Figure 2 The digestion verification of recombinant plasmid pGL3-Cdc2-promoter by endonucleases圖2 重組質(zhì)粒pGL3-Cdc2-promoter雙酶切鑒定

3 討論

在哺乳動物細胞中，細胞周期是在一系列細胞周期素依賴性激酶（CDKs）和催化亞基周期素（cy?clins）共同調(diào)節(jié)下忠實而有序地啟動和完成的細胞周期事件。細胞周期的基本順序是G1-S-G2-M。CyclinD-CDK4/6和cyclinE-CDK2作用于G1期并推動G1/S進程。Cdc2與cyclinB家族蛋白結(jié)合形成MPF是細胞順利進行S期及G2/M轉(zhuǎn)變的必要保障[5]。然而近年研究發(fā)現(xiàn)，在CDK2敲除的情況下，Cdc2可與cylclinE形成復合物，代替CDK2的功能，促進G1/S的轉(zhuǎn)換[6]。Cdc2對整個細胞分裂進程的調(diào)節(jié)起著中心作用。

Figure 3 Sequence peaks of Cdc2 promoter and comparison results of BLAST圖3 Cdc2啟動子的測序峰圖及BLAST比對結(jié)果

通過凝膠阻滯實驗、基因足跡分析Cdc2的啟動子，發(fā)現(xiàn) ATF、Sp1、CCAAT 盒、CDE/CHR、est-2、E2F、cMyb和 IG（E-box）等多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點[7-8]。它們共同調(diào)節(jié)著Cdc2在不同信號通路下的表達。E2F是最早開始研究，也是研究得最為透徹的Cdc2啟動子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。CyclinD-CDK4/6激酶復合體可磷酸化Rb/E2F復合體中的Rb蛋白，使E2F轉(zhuǎn)錄因子得以釋放出來與Cdc2啟動子結(jié)合，從而起始Cdc2的轉(zhuǎn)錄表達。CyclinD-CDK4/6復合體受p15、p16、p18、p19、p21等細胞周期素依賴性激酶抑制蛋白（cyclin-dependent kinese inhibitors,CKI）的負向調(diào)節(jié)。許多腫瘤細胞，例如U2OS、HeLa等，p16表達缺如，導致Cdc2蛋白過度表達，細胞周期調(diào)控失衡，細胞過度增生形成腫瘤[4]。

細胞周期調(diào)控異常是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要生物學基礎(chǔ)。CDKs的表達及活性的調(diào)控異常是惡性腫瘤的共同特征，這使得CDK蛋白家族成為抗癌藥物極具前景的靶點[9]。Cdc2的過表達會引起細胞惡性增殖，而且Cdc2的表達量與腫瘤的發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移及復發(fā)等明顯相關(guān)。已有研究表明，在結(jié)腸癌[10]、肝癌[11]、非小細胞肺癌[12]、前列腺癌[13]等腫瘤細胞中都檢測到Cdc2過表達。Elangovan等[14]發(fā)現(xiàn)三烯生育酚能通過抑制CDK4和cyclinD1的表達，抑制Rb的磷酸化，阻礙下游E2F轉(zhuǎn)錄因子與Cdc2啟動子的結(jié)合，下調(diào)Cdc2的轉(zhuǎn)錄表達，阻滯乳腺癌細胞的分裂增殖，達到治療乳腺癌的目的。

熒光素酶報告基因法是目前用于分析轉(zhuǎn)錄調(diào)控的常用方法。本研究通過將Cdc2基因的啟動子序列克隆至含熒光素酶的報告基因而無啟動子的表達質(zhì)粒PGL3-basic中，并與含海腎熒光素酶的內(nèi)參質(zhì)粒pRL-SV40共轉(zhuǎn)染到骨肉瘤細胞U2OS細胞中，通過檢測熒光素酶的表達量反映啟動子序列的活性，間接反映Cdc2基因在細胞中的轉(zhuǎn)錄表達水平，并驗證了其活性。值得注意的是，XhoⅠ對超螺旋狀態(tài)的pGL3-Basic質(zhì)粒酶切不完全，但是對線性質(zhì)粒的酶切效果良好。所以筆者在做質(zhì)粒的雙酶切時，先用SacⅠ將超螺旋質(zhì)粒酶切成為線性質(zhì)粒后再加入XhoⅠ，取得了良好的效果。

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