崔 麗 李廣平 富華穎 王興華 焦占全

Toll樣受體4（Toll like receptor-4，TLR4）是近年來新發(fā)現(xiàn)的細胞跨膜受體，被認為是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁，越來越多的證據(jù)表明TLR4介導的免疫反應參與血管復雜的炎性反應過程[1]，在動脈粥樣硬化的形成和進展、再狹窄的發(fā)生[2]、心肌缺血再灌注（I/R）損傷中發(fā)揮著重要作用[3]。RNA干擾（RNAi）是一種特異性的基因沉默技術，能抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。本研究通過構建靶向TLR4基因的小干擾RNA（siRNA）真核表達載體，并建立穩(wěn)定降低內(nèi)源TLR4表達的血管平滑肌細胞（SMC），探討siRNA對SMC中TLR4基因表達的抑制作用，同時為研究TLR4對血管平滑肌的細胞增殖、遷移的作用機制提供細胞模型。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株及細胞 質(zhì)粒pSilence 2.1-U6 neo、pSi?lence2.1-NC（陰性對照）及大腸桿菌DH5α（E.coliDH5α）由天津市心血管病研究所惠贈。pSilence 2.1-U6 neo質(zhì)粒帶有U6啟動子，并包含HindⅢ及BamHⅠ2個限制性內(nèi)切酶酶切位點。pSilence2.1-NC質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶酶切位點間攜帶無義序列作為對照。兔主動脈血管平滑肌細胞（CC-SMC）購自北京軍事醫(yī)學科學院協(xié)和細胞中心。

1.1.2 酶類及主要材料 限制性內(nèi)切酶HindⅢ、BamHⅠ及T4 DNA連接酶，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒（Invitrogen公司）；UNIQ-10柱總RNA抽提試劑盒（上海生工），高純度質(zhì)粒中量提取試劑盒（QIAGEN公司），鼠抗兔TLR4多克隆抗體（Abcom公司），鼠抗兔GAPDH單克隆抗體（北京賢至生物公司），辣根過氧化酶標抗鼠IgG（美國Sigma）。小發(fā)夾RNA（shRNA）寡核苷酸DNA序列合成由北京六合華大基因科技股份有限公司完成，基因測序由北京三博遠志生物技術有限責任公司完成。

1.2 方法

1.2.1 TLR4 shRNA序列的設計 依據(jù)GenBank查序獲得兔TLR4 mRNA序列（NM_001082732），通過BLAST分析設計針對TLR4的序列中3個特異序列作為干擾組靶序列，兩端酶切位點分別為HindⅢ和BamHⅠ，序列見表1。以下將TLR4 shRNA的DNA序列稱為siRNA-TLR4-1、siRNA-TLR4-2、siRNA-TLR4-3，表達上述序列的pSilence 2.1質(zhì)粒稱為pSilence2.1-siTLR4-1、pSilence2.1-siTLR4-2、pSilence2.1-siTLR4-3。

1.2.2 重組質(zhì)粒pSilence2.1-siTLR4的構建和鑒定 選取HindⅢ、BamHⅠ的雙酶切位點對質(zhì)粒pSilence 2.1-U6 neo質(zhì)粒進行雙酶切，“V”型槽電洗脫法回收線性化的載體。用T4 DNA連接酶將線性化的pSilence 2.1-U6 neo質(zhì)粒載體分別與退火后siRNA-TLR4雙鏈片段進行連接過夜。采用CaCl2法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，涂布于氨芐抗性的LB培養(yǎng)平板，37℃溫箱培養(yǎng)過夜，挑取陽性克隆搖菌并提取重組質(zhì)粒。用HindⅢ、BamHⅠ分別酶切重組pSilence2.1-siTLR4質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定是否連接成功，同時對酶切成功的質(zhì)粒進行基因測序，測序引物序列上游：5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′。下游：5′-GAGTTAGCTCACT?CATTAGGC-3′。測序鑒定正確后，采用高純度質(zhì)粒中量提取試劑盒分別提取重組質(zhì)粒。

1.2.3 細胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 SMC應用常規(guī)HG-DMEM培養(yǎng)液（10%FBS、100 mg/L青霉素、10 mg/L鏈霉素）于37℃，95%空氣和5%CO2混合氣體的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；細胞生長融合達100%時，采用消化法將SMC傳代至60 mm培養(yǎng)皿中，5×106個細胞/孔，每孔中加4 mL HG-DMEM培養(yǎng)液（含10%FBS，無抗生素）。次日待SMC融合50%～70%，采用陽離子脂質(zhì)體法將純化的重組質(zhì)粒pSilence2.1-siTLR4-1、pSilence2.1-siTLR4-2、pSilence2.1-siTLR4-3和 pSilence2.1-NC轉(zhuǎn)染SMC，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒（包括LipofectamineTMLTX Re?agent和PLUSTMReagent）說明書操作，各皿質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染量為1 μg。轉(zhuǎn)染48 h后更換為含400 μg/L G418的HG-DMEM選擇培養(yǎng)液，每3 d換液1次，待作為空白對照的未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的SMC全部死亡后，將G418濃度更改為200 μg/L維持篩選，2～3周后可見陽性克隆出現(xiàn)，選取孤立良好的克隆，將其消化轉(zhuǎn)移至24孔板，待細胞再次形成克隆后轉(zhuǎn)移至60 mm細胞培養(yǎng)板，擴大培養(yǎng)。

1.2.4 RT-PCR檢測TLR4 mRNA水平 收集各組SMC，PBS洗滌細胞沉淀，UNIQ-10柱總RNA抽提試劑盒提取細胞總RNA，紫外分光光度法檢測總RNA純度并定量，取總RNA 1 μg逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。擴增特異的TLR-4序列，擴增引物上游：5′-TTCAAGGGCTGAGTGGT-3′。下游：5′-CGAGGT?CATCTATGTATGCT-3′；反應體系（25 μL）：dNTP（各 2.5 mmol/L）0.5 μL，20 μmol/L TLR-4上、下游引物各0.5 μL，GAP?DH上、下游引物各0.1 μL，Taq DNA聚合酶1.0 U，5×Buffer[75 mmol/L(NH4)2SO4，300 mmol/LTris-HCl，MgCl21.5 mmol/L，pH 9.5]5 μL，ddH2O 17.05 μL，模板cDNA 1 μL。循環(huán)反應條件：94℃預變性5 min；94℃ 變性30 s，55℃ 退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸7 min；3%瓊脂糖凝膠，100 V電泳40 s，分離PCR擴增產(chǎn)物，3%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴增產(chǎn)物，Gel-pro 3.1凝膠成像分析系統(tǒng)對凝膠進行掃描，測定TLR4及GAPDH表達條帶的灰度值，兩者灰度比值（TLR4/GAPDH）作為TLR4 mRNA的相對表達量。

1.2.5 Western blot檢測TLR4蛋白的表達 收集各組SMC，PBS洗滌細胞沉淀，RIPA細胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑）裂解細胞，按照考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒說明書測定蛋白濃度，將蛋白濃度均一化為1.2 g/L，取20 μL總蛋白樣品，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，PBS Buffer洗膜3次，分別加入1∶500稀釋的TLR4鼠抗兔多克隆抗體和1∶500稀釋的GAPDH鼠抗兔單克隆抗體，37℃震蕩1 h，4℃過夜。洗膜、1∶4 000羊抗鼠二抗孵育2 h，洗膜、顯色、X線片曝光，掃描并攝取圖像，使用TotalLab分析底片上條帶，以TLR4/GAPDH灰度比值作為TLR4蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 重組siRNA-TLR4表達質(zhì)粒的鑒定結果 DNA測序證實重組質(zhì)粒pSilence2.1-siTLR4-1、pSi?lence2.1-siTLR4-2、pSilence2.1-siTLR4-3中插入的siRNA-TLR4基因片段未出現(xiàn)堿基突變、錯配等異常，基因序列完全正確。

2.2 不同重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對SMC TLR4 mRNA抑制效率 陰性對照質(zhì)粒pSilence-2.1-NC轉(zhuǎn)染對SMC TLR4 mRNA表達無影響，與空白對照組細胞相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而TLR4-siRNA的3個重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后篩選的SMC中TLR4 mRNA表達較正常及陰性對照質(zhì)粒明顯降低（P＜0.05），其中以pSilence2.1-siTLR4-1的抑制作用最強，見表2。

Table1 Specific target sequences for TLR4 siRNA and synthesized shRNA oligonucleotides表1 TLR4的靶序列及合成的shRNA oligo DNA序列

Table 2 The expression of TLR4 mRNA in transfected SMCs表2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后SMC中TLR4 mRNA表達情況（±ss）

Table 2 The expression of TLR4 mRNA in transfected SMCs表2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后SMC中TLR4 mRNA表達情況（±ss）

＊Plt;0.05，＊＊Plt;0.01

q組別空白對照組(1)pSilence2.1-NC組(2)pSilence2.1-siTLR4-1組(3)pSilence2.1-siTLR4-2組(4)pSilence2.1-siTLR4-3組(5)F n 3 3 3 3 3 TLR4 mRNA表達量1.27±0.08 1.21±0.04 0.33±0.12 0.41±0.05 0.53±0.05 107.8＊＊統(tǒng)計學處理組比(1)∶(2)(1)∶(3)(1)∶(4)(1)∶(5)(2)∶(3)(2)∶(4)(2)∶(5)1.341 21.019*19.230*16.547*19.677*17.889*15.205*

2.3 不同重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對SMC細胞TLR4蛋白表達抑制效果 與空白對照組相比，陰性對照質(zhì)粒pSi?lence2.1-NC轉(zhuǎn)染后SMC中TLR4蛋白表達水平差別不明顯，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的SMC中TLR4蛋白表達水平明顯低于空白對照組及pSilence2.1-NC組，其中pSilence2.1-siTLR4-1組、pSilence2.1-siTLR4-2組、pSilence2.1-siTLR4-3組TLR4蛋白表達水平分別降低為空白對照組的30%、42%和66%，其中質(zhì)粒pSilence2.1-siTLR4-1的抑制效果最好，見圖1。

3 討論

3.1 Toll樣受體4的功能 Toll樣受體4作為跨膜蛋白受體，其組織分布廣泛，除單核/巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞（DC）外，在心血管系統(tǒng)中的心肌細胞、血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞以及外膜的成纖維細胞均有表達，主要特異性地識別、結合病原相關分子模式（PAMPs）[4]，并通過髓樣分化蛋白88（MyD88）依賴性和非依賴性途徑由胞外向胞內(nèi)傳導信號，參與促炎反應、促進免疫細胞成熟分化及免疫應答的調(diào)節(jié)。研究表明，活化的TLR4可通過激活核因子（NF）-κB，誘導產(chǎn)生炎癥因子白細胞介素（ILs）、腫瘤壞死因子（TNF）-α、黏附因子（VCAM）-1及趨化因子（MCP）-1等多種因子促進SMC增殖并參與血管炎癥反應。Otsui等[4]研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者冠狀動脈SMC中TLR4的表達明顯上升；Versteeg等[5]研究顯示不穩(wěn)定型心絞痛患者TLR4及其介導的信號通路因子表達上調(diào)，介入治療后TLR4表達下降，表明TLR4可作為穩(wěn)定型心絞痛患者發(fā)生心肌缺血的潛在標志物。此外，抑制TLR4的表達可減弱動脈損傷后的SMC和血管重塑[6]，因此抑制TLR4的表達有可能成為防止動脈粥樣硬化和再狹窄的有效靶點。

3.2 siRNA表達載體構建的意義 RNA干擾是真核生物基因轉(zhuǎn)錄后沉默的重要機制之一，通過導入外源雙鏈RNA，引起生物體或細胞內(nèi)同源mRNA降解，從而發(fā)生序列特異性基因沉默，已成為研究基因功能、基因治療和尋找藥物靶點的重要工具。本研究分別選取TLR4 mRNA的3段21個寡核苷酸序列作為干擾片段，合成小發(fā)夾雙鏈RNA質(zhì)粒載體并成功轉(zhuǎn)染入SMC，在細胞RNA聚合酶Ⅲ的作用下釋放出siRNA短片段，誘導靶向TLR4 mRNA降解。本實驗中，經(jīng)RT-PCR及Western blot證實siRNA組TLR4 mRNA及蛋白表達明顯低于空白對照組，表明TLR4-siRNA對TLR4 mRNA及蛋白表達水平均具有抑制作用，其中pSilence2.1-siTLR4-1的抑制作用最強，提示RNAi能有效下調(diào)血管SMC中TLR4基因的表達。同時通過G418抗性篩出穩(wěn)定下調(diào)TLR4基因表達的血管SMC，為下一步研究TLR4對血管SMC增殖、遷移的作用機制提供了細胞模型，有助于深入探討TLR4在動脈粥樣硬化及再狹窄中的作用。

Figure 1 TLR4 protein expressions in transfected SMC cells圖1 各組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后SMC中TLR4蛋白表達情況

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