伍賢進(jìn)，牛友芽，周 ，魏 林，李勝華，魏 麟

(1.懷化學(xué)院 生命科學(xué)系/民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/湘西藥用植物與民族植物學(xué)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 懷化 418008;2.湖南省植物保護(hù)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125)

魚腥草(Houttuynia cordataThunb.)為三白草科蕺菜屬多年生藥食兼用草本植物[1].研究和臨床實(shí)踐表明，魚腥草具有抗菌[1，2]、抗炎[1，3]、抗病毒[1，4]、抗氧化[5]等多種藥理作用，能清熱解毒、消腫排膿、利尿通淋，可用于治療肺膿潰瘍、肺熱咳喘、熱痢熱淋、水腫、腳氣、尿路感染、白帶過多、癰腫瘡毒等癥[1].魚腥草嫩莖葉和根狀莖風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富、養(yǎng)生保健作用良好，是頗具特色的食品，而且根狀莖一年四季可采[1].因此，魚腥草用量很大，湖南、貴州、四川等地均進(jìn)行了大面積人工栽培[1，6].野生魚腥草對(duì)病蟲害的抵抗力較強(qiáng)，很少發(fā)生病蟲危害，但人工栽培后白絹病的發(fā)病非常普遍，可導(dǎo)致成片死亡，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和品質(zhì)[1，6，7，8].但目前對(duì)魚腥草白絹病的防治并無十分有效的辦法[1，6，7，8，9]，而且由于安全性的需要，魚腥草病害防治用藥要求十分嚴(yán)格[1，8，9].生物防治和選擇低毒、低殘留的化學(xué)藥劑是魚腥草白絹病防治的重要措施[1，8，9].木霉菌是自然界中普遍存在的一類真菌，大多數(shù)對(duì)植物病原真菌具有拮抗作用[10，11].哈茨木霉是木霉菌屬中研究較多且已走向商品化的種群，其安全性和有效性已廣為認(rèn)可，在花生、辣椒白絹病防治中已取得較好效果[12，13]，對(duì)魚腥草白絹病的防治也有報(bào)道[6，14].三唑酮是一種高效、低毒、低殘留的殺菌劑，已證明對(duì)魚腥草白絹病病原菌有一定的抑菌效果[1，8].雖然三唑酮對(duì)包括哈茨木霉在內(nèi)的真菌有一定抑制作用，但也有其能增強(qiáng)哈茨木霉防治辣椒白絹病的報(bào)道[13]，但應(yīng)用到魚腥草中效果如何還有待研究.為了能充分發(fā)揮化學(xué)防治和生物防治的各自優(yōu)勢(shì)，尋找防治魚腥草白絹病的安全有效方法，本研究探討了三唑酮對(duì)哈茨木霉防治魚腥草白絹病的協(xié)同作用.

1 材料與方法

1.1 魚腥草與哈茨木霉

供試魚腥草(Houttuynia cordataThunb.)品種為懷化學(xué)院選育的“湘白魚腥草” (湖南省作物品種審定委員會(huì)，品種登記號(hào):XPD017-2009)，用根狀莖為繁殖材料，按規(guī)范化栽培技術(shù)規(guī)程要求栽培于懷化市鶴城區(qū)楊村鄉(xiāng)湖南正清制藥集團(tuán)魚腥草規(guī)范化栽培基地[1].

哈茨木霉(Trichoderma huzirum)T2-16 由湖南省植物保護(hù)研究所提供.

1.2 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g、蔗糖或葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、蒸餾水1 000 ml.

1.3 魚腥草白絹病病原菌的分離

在栽培基地取患白絹病的魚腥草植株，在超菌工作臺(tái)中用剪刀將莖剪成約0.5 cm 長(zhǎng)的小段，將小段緣縱切面剪開，放入75%的酒精中浸泡1-2 min 后，取出放入無菌水中清洗3次，用鑷子夾入PDA 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每皿放入4 片，成正方形排列，于27 ±1℃恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)3 d，待培養(yǎng)皿中長(zhǎng)出輻射狀的菌絲，再用接種針挑取無污染的菌絲放入另一PDA 平板培養(yǎng)基中再培養(yǎng)3 d，即分離得到白絹病病原菌.

1.4 哈茨木霉協(xié)同化學(xué)抗菌劑的篩選

根據(jù)魚腥草化學(xué)防治的情況[1，8，9]，以下化學(xué)抗菌劑用于協(xié)同抗菌劑的候選.50% 多菌靈可濕性粉劑、25%甲霜靈可濕性粉劑 (上海脫聯(lián)化工有限公司)，15%三唑酮可濕性粉劑 (江蘇七洲綠色化工有限公司)，70%施普樂甲托超微復(fù)合可濕性粉劑 (簡(jiǎn)稱“甲托”，天津施普農(nóng)藥技術(shù)發(fā)展有限公司)，40%土凈凈粉劑(山西臨汾有機(jī)化工廠).

分別將5種化學(xué)抗菌劑配制濃度為50 μg/ml的PDA 培養(yǎng)基，將白絹病病原菌和哈茨木霉T2-16 接種到培養(yǎng)基中培養(yǎng)觀察菌絲的生長(zhǎng)情況及菌核出現(xiàn)的情況，篩選出白絹病生長(zhǎng)抑制性強(qiáng)但對(duì)哈茨木霉T2-16的生長(zhǎng)的抑制性較弱的化學(xué)抗菌劑，每種抗菌劑均重復(fù)3次.

1.5 化學(xué)抗菌劑與哈茨木霉對(duì)魚腥草白絹病病原菌協(xié)同抑制作用

在PDA 平板培養(yǎng)基上，一端接種已培養(yǎng)3 d的直徑為5 mm的哈茨木霉菌塊，對(duì)稱一端接種相同條件下培養(yǎng)3 d的直徑亦為5 mm的魚腥草白絹病病原菌塊，在25℃下恒溫培養(yǎng)，觀察哈茨木霉對(duì)白絹病病原菌生長(zhǎng)的影響情況.另用含有濃度為50 μg/ml 篩選出的化學(xué)抗菌劑的PDA 平板培養(yǎng)基上重復(fù)同樣操作.兩種培養(yǎng)基下均以不接種哈茨木霉為對(duì)照，所有處理均在25℃下恒溫培養(yǎng)，觀察菌苔的生長(zhǎng)情況以及菌核的出現(xiàn)情況，每個(gè)處理均重復(fù)5次.

1.6 魚腥草白絹病的協(xié)同防治

1.6.1 哈茨木霉孢子粉制劑的制備

將稻草秸稈粉碎成粉末，按照1∶0.6 比例加入濃度為5%的(NH4)2SO4溶液，攪拌均勻，用罐頭瓶分裝，高壓蒸汽滅菌并冷卻至室溫后接種哈茨木霉，27±1℃恒溫箱中培養(yǎng)培養(yǎng)7 d，即得到深綠色木霉孢子粉制劑，培養(yǎng)期間每天將罐頭瓶搖勻.

1.6.2 白絹病菌核制備

將白絹病病原菌絲在PDA 平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d至菌絲上布滿深褐色顆粒狀菌核.

1.6.3 魚腥草白絹病的防治

將生長(zhǎng)良好的盆栽魚腥草接種白絹病菌核培養(yǎng)3 d后分成A、B、C、D 四組，每組四盆，進(jìn)行如下處理:A組每盆噴灑濃度為250 μg/ml的三唑酮溶液;B組每盆按30 g/m2播撒哈茨木霉孢子粉;C組每盆同時(shí)噴灑250 μg/ml的三唑酮溶液和播撒30 g/m2哈茨木霉孢子粉;D組盆為對(duì)照，不做任何處理.觀察防治效果.

防治效果= (對(duì)照發(fā)病率-處理發(fā)病率)/對(duì)照發(fā)病率×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 哈茨木霉和魚腥草白絹病病原菌在PDA 培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況

圖1說明，哈茨木霉和魚腥草白絹病病原菌均能在PDA 培養(yǎng)基上迅速生長(zhǎng)，培養(yǎng)5 d 就幾乎能將直徑為9 cm的培養(yǎng)皿長(zhǎng)滿.

圖1 哈茨木霉和魚腥草白絹病病原菌在PDA 培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況

2.2 化學(xué)抗菌劑對(duì)魚腥草白絹病病原菌和哈茨木霉生長(zhǎng)的影響

表1顯示不同化學(xué)抗菌劑對(duì)魚腥草白絹病病原菌生長(zhǎng)的影響差異較大，土凈凈的抑制作用最強(qiáng)，其次為三唑酮和甲托，而甲霜靈和多菌靈的抑制作用則不很明顯.而對(duì)于哈茨木霉，5種化學(xué)抗菌劑均能抑制其生長(zhǎng)，作用大小依次為土凈凈＞甲托＞甲霜靈＞多菌靈＞三唑酮(表2).鑒于三唑酮對(duì)哈茨木霉生長(zhǎng)的抑制作用較小，而且對(duì)魚腥草中白絹病病原菌生長(zhǎng)的抑制作用較強(qiáng)，故可作為和哈茨木霉協(xié)同防治魚腥草白絹病的化學(xué)抗菌劑.

表1 不同化學(xué)抗菌劑對(duì)魚腥草白絹病病原菌生長(zhǎng)直徑的影響(單位:cm)

表2 不同化學(xué)抗菌劑對(duì)中哈茨木霉生長(zhǎng)直徑的影響(單位:cm)

2.3 三唑酮協(xié)同哈茨木霉對(duì)魚腥草白絹病病原菌生長(zhǎng)的影響

表3說明，哈茨木霉對(duì)魚腥草白絹病菌生長(zhǎng)有很強(qiáng)的拮抗作用，無哈茨木霉時(shí)培養(yǎng)4-5 d 病菌即長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿并形成菌核，7 d 后菌核密布，而接種了哈茨木霉的培養(yǎng)皿在生長(zhǎng)第2 d 兩種菌的菌落就開始接觸，之后白絹病病原菌菌落逐漸變小，到第5 d 病菌菌落僅為對(duì)照的1/2，且菌絲細(xì)弱、色淡、不產(chǎn)生菌核，到第7 d 時(shí)，病原菌菌絲幾乎全部死亡.

表3 哈茨木霉對(duì)魚腥草白絹病病原菌生長(zhǎng)的抑制作用

用50 μg/ml 三唑酮配制的PDA 培養(yǎng)基的培養(yǎng)結(jié)果見表4，比較表3和表4結(jié)果明顯發(fā)現(xiàn)，加入三唑酮后魚腥草白絹病病原菌生長(zhǎng)所受抑制作用更明顯，病菌衰退時(shí)間變短，菌核出現(xiàn)的時(shí)間也進(jìn)一步推遲，說明哈茨木霉與三唑酮對(duì)魚腥草白絹病病原菌的生長(zhǎng)抑制作用具有明顯的正協(xié)同作用.

表4 哈茨木霉及三唑酮對(duì)魚腥草白絹病病原菌生長(zhǎng)的協(xié)同抑制作用

2.4 三唑酮與哈茨木霉對(duì)魚腥草白絹病的協(xié)同防治作用

表5顯示，未經(jīng)三唑酮或哈茨木霉防治的對(duì)照魚腥草均發(fā)生了白絹病，說明接種十分成功，三唑酮、哈茨木霉對(duì)魚腥草弊絹病均有明顯的防治作用，可降低發(fā)病率，延遲發(fā)病時(shí)間.從防治率和延遲發(fā)病時(shí)間兩方面看，三種處理的防治效果依次均為:三唑酮+哈茨木霉＞三唑酮＞哈茨木霉，說明三唑酮與哈茨木霉在魚腥草白絹病防治上具有良好的正協(xié)同作用.

表5 哈茨木霉與三唑酮對(duì)魚腥草白絹病的協(xié)同防治作用

3 討論

白絹病是魚腥草主要病害，且整個(gè)生育期都能危害，嚴(yán)重時(shí)能造成大面積減產(chǎn).雖然化學(xué)藥劑對(duì)魚腥草白絹病具有較好的防治效果，但存在著持效期短，環(huán)境污染等問題[1，8，9].而且，因?yàn)樗幱煤褪秤玫奶厥庖?，安全性是魚腥草化學(xué)防治需要考慮的首要問題，人工栽培魚腥草白絹病的防治是一個(gè)較大的難題.本試驗(yàn)結(jié)果表明，土凈凈、甲托、三唑酮等化學(xué)抗菌劑對(duì)魚腥草白絹病病原菌生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用，哈茨木霉對(duì)魚腥草白絹病病原菌生長(zhǎng)和魚腥草白絹病的發(fā)生也有較強(qiáng)的抑制作用，這與前人的研究結(jié)果一致[1，6，9].已有研究發(fā)現(xiàn)，三唑酮對(duì)木霉防治辣椒白絹病有較好的協(xié)同作用[13].本研究表明，三唑酮對(duì)魚腥草白絹病病原菌的生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用，但對(duì)哈茨木霉菌生長(zhǎng)的抑制作用則較小，而且三唑酮與哈茨木霉在防治魚腥草白絹病方面具有明顯的正協(xié)同作用，這一研究結(jié)果為魚腥草生產(chǎn)中提供了一個(gè)相對(duì)高效、安全的白絹病防治方案.

化學(xué)抗菌劑與哈茨木霉協(xié)同防治魚腥草白絹病可同時(shí)發(fā)揮化學(xué)抗菌劑起效快、生物防治持續(xù)時(shí)間久的兩種優(yōu)勢(shì)，而且哈茨木霉還有促進(jìn)魚腥草生長(zhǎng)發(fā)育的作用[14].因此，根據(jù)本研究和前人研究結(jié)果，在魚腥草人工栽培中多使用哈茨木霉對(duì)于提高生產(chǎn)效益是十分有利的.但鑒于白絹病的發(fā)病特點(diǎn)，在魚腥草生產(chǎn)中，還必須貫徹“預(yù)防為主、綜合防治”的策略，充分發(fā)揮物理防治、生物防治、化學(xué)防治的各自優(yōu)勢(shì)，做到取長(zhǎng)補(bǔ)短、優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，才能使白絹病控制達(dá)到理想狀態(tài)，且符合中藥材和食品的生產(chǎn)要求.

[1]伍賢進(jìn).魚腥草種質(zhì)資源與規(guī)范化栽培技術(shù)研究[M].北京:科學(xué)出版社，2011.

[2]Kim G S，Kim D H，Lim J J，et al.Biological and antibacterial activities of the natural herb Houttuynia cordata water extract against the intracellular bacterial pathogen salmonella within the RAW 264.7 macrophage[J].Biol Pharm Bull，2008 (11):2012-2017.

[3]Kim D，Park D，Kyung J，et al.Anti-inflammatory effects of Houttuynia cordata supercritical extract in carrageenan-air pouch inflammation model[J].Lab Anim Res，2012 (2):137-140.

[4]Chen X Q，Wang Z X，Yang Z Y，et al.Houttuynia cordata blocks HSV infection through inhibition of NF-κB activation[J].Antiviral Res，2011 (2):341-345.

[5]Toda S.Antioxidative effects of polyphenols in leaves of Houttuynia cordata on protein fragmentation by copper-hydrogen peroxide in vitro[J].J Med Food，2005 (2):266-268.

[6]唐莉，吳錫明，馬曲，等.魚腥草白絹病發(fā)生發(fā)展規(guī)律及防治方法研究[J].中草藥，2005，12 (36):1872-1874.

[7]李濤，張圣喜，張立，等.土壤肥力與魚腥草白絹病發(fā)生的關(guān)系[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，35 (3):317-319.

[8]李濤，張圣喜，伍賢進(jìn)，等.魚腥草白絹病綜合防治配套技術(shù)措施[J].中國(guó)農(nóng)村小康科技，2010 (4):40-42.

[9]陳連發(fā)，秦利紅，蔣雪榮.魚腥草白絹病防治試驗(yàn)簡(jiǎn)報(bào)[J].南方園藝，2014，25 (5):24-25.

[10]丁萬隆，程惠珍，張國(guó)珍.木霉在藥用植物病害防治上的應(yīng)用[J].中草藥，1997，28 (8):505-507.

[11]丁萬隆，程惠珍，張國(guó)珍，等.木霉防治西洋參立枯病研究[J].中草藥，1994，25 (2):91-92.

[12]李良.哈茨木霉防治花生、辣椒白絹病[J].植物保護(hù)，1987，13 (3):19-20.

[13]燕嗣皇，陸德清，楊雨環(huán).三唑酮對(duì)木霉防治辣椒白絹病的協(xié)同作用[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1998，11(4):101-105.

[14]魏林，梁志懷，陳玉榮，等.Trichoderma harzianumTUV-13 對(duì)魚腥草白絹病的防治及其促生長(zhǎng)作用[J].中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2012，28 (3):381-386.