賀安娜，滕 攀

(懷化學(xué)院1.生命科學(xué)系;2.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3.湘西藥用植物與民族植物學(xué)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 懷化 418008)

虎耳草 (Saxifraga stoloniferaCurt.)又名石荷葉、金線吊芙蓉、老虎耳等.生于海拔400-4 500米的林下、灌叢、草甸和蔭濕巖隙[1].全草入藥，具有清熱解毒、祛濕消腫、涼血止血的功效，可用于止咳抗炎等[2].虎耳草含量較高的成分主要有虎耳草素、有機(jī)酸類、黃酮類[3，4].丁家欣用HPLC 法測定不同產(chǎn)地及不同收季虎耳草中的巖白菜素的含量，發(fā)現(xiàn)湖北洪山所產(chǎn)虎耳草含量最高[5]，黃志金等對虎耳草不同部位巖白菜素含量進(jìn)行了測定，研究表明葉中巖白菜素的含量最高[6].近年有研究報(bào)道，虎耳草有抑制前列腺癌的作用[7]，對虎耳草有效成分提取及抗癌活性的研究逐步增多[8，9].

植物的種內(nèi)或種間關(guān)系目前主要通過形態(tài)性狀[10]、分子標(biāo)記[11]等技術(shù)手段進(jìn)行聚類分析.曾苗春等[12]對不同居群的虎耳草葉的顏色、葉背的顏色等形態(tài)特征進(jìn)行了比較，通過歐式距離聚類分析，得出不同居群虎耳草的親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近.植物生態(tài)型之間在外觀形狀上不一定有明顯的區(qū)分界限，它們更多的是表現(xiàn)在生理生化特性上的差異[13]，植物因素如葉片氣孔導(dǎo)度、氣孔阻力等是植物長期適應(yīng)多變的環(huán)境和土壤而形成的一類自身調(diào)節(jié)因素[14].本文測定虎耳草不同居群光合特性及有效成分含量，并對其進(jìn)行相關(guān)性分析，為篩選虎耳草優(yōu)異種質(zhì)資源提供依據(jù)，也為虎耳草的高效栽培提供參考.

1 試劑與材料

巖白菜素對照品和沒食子酸對照品(中國藥品生物制品鑒定所)，純度≥98%.甲醇為色譜純，水為純凈水，其余試劑為分析純.

不同居群虎耳草材料的來源地及移栽時(shí)間，詳見表1.各居群虎耳草均栽種于盆中，盆上口徑為22 cm，底部直徑15 cm，高20 cm，置于懷化學(xué)院生物園樹蔭下，透光率約為35%.

表1 9個(gè)不同居群虎耳草來源

2 方法

2.1 氣體交換參數(shù)測定

于2014年4月中旬天氣晴朗無風(fēng)日的上午9:00—11:00，采用Li-6400 便攜式光合測定系統(tǒng)(美國LI-COR公司)，選擇不同居群虎耳草的健壯植株并長勢一致的正常功能葉10 片進(jìn)行測定，取平均值.記錄其凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導(dǎo)度(Gs)及胞間CO2濃度(Ci)等.

2.2 葉綠素含量測定

在完成不同居群虎耳草的光合參數(shù)測定后，隨即采取相應(yīng)的正常功能葉片，用95%乙醇提取葉綠素，采用紫外可見分光光度計(jì)(日本島津UV-2550)進(jìn)行測定.

2.3 巖白菜素和沒食子酸含量測定

分別采集虎耳草春葉和秋葉樣品，進(jìn)行干燥處理至恒重，粉碎并通過120 目篩，備用.精確稱取1.0 g虎耳草粉末，用甲醇提取，料液比為1∶25 (g∶mL)，裝入50 mL 錐形瓶中，超聲波提取35 min，重復(fù)提取一次.所得濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至約5 mL，用甲醇定容至25 mL，經(jīng)0.22 μm 針孔濾膜過濾.含量測定采用LC-20AT 高效液相色譜儀(日本島津)進(jìn)行，色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18 (150 mm ×4.6 mm，5 μm).流動相:甲醇-0.1%磷酸溶液(73∶29);流速:1.02 ml/min;檢測波長:272 nm;柱溫25℃;進(jìn)樣量:20 μL.按外標(biāo)法以峰面積積分值計(jì)算巖白菜素和沒食子酸的含量.

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所測定結(jié)果取平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，利用Excel 及SPSS16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與相關(guān)性分析.

3 結(jié)果與分析

3.1 氣體交換參數(shù)比較

不同居群虎耳草的氣體交換參數(shù)存在較大差異，如其凈光合速率(Pn)變化范圍為4.12-6.85 μmol·m-2·s-1(表2)，其中Pn 最高的居群為2號居群，最低的為5號居群;蒸騰速率最高的居群則是9號居群，為4.95 mmol·m-2·s-1;水分利用率最高的居群為7號居群，為2.66 mol·m-2·s-1;胞間二氧化碳濃度差異較小.

表2 9個(gè)虎耳草居群氣體交換參數(shù)比較

3.2 葉綠素含量比較

不同居群虎耳草的葉綠素含量差異較大，其中2號居群葉綠素a 含量最高，為0.7481.01 mg·g-1，總?cè)~綠素含量也最高，為1.01 mg·g-1(表3)，說明2號居群有較高光合能力，葉綠素含量最低的為7號居群，僅0.345 mg·g-1.葉綠素a/b的值在3 左右，最高的為5號居群，為3.29，最小的是2號居群，僅2.09.

表3 9個(gè)虎耳草居群葉綠素含量比較

3.3 巖白菜素及沒食子酸含量比較

9個(gè)不同居群虎耳草中，巖白菜素和沒食子酸含量變化不一致(表4)，巖白菜素含量稍高于沒食子酸含量.巖白菜素含量最高的為2號居群，為3.94 mg·g-1，最低的7號居群僅1.48 mg·g-1;沒食子酸含量最高的是3號居群，為1.91 mg·g-1，最低的也是7號居群，僅0.512 mg·g-1.

表4 9個(gè)虎耳草居群巖白菜素及沒食子酸含量比較

3.4 光合參數(shù)與有效成分的相關(guān)性分析

將9個(gè)居群虎耳草的光合參數(shù)及有效成分含量進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)凈光合速率與氣孔導(dǎo)度、總?cè)~綠素含量及巖白菜素含量都呈正相關(guān)，其中與總?cè)~綠素含量達(dá)極顯著正相關(guān)，與巖白菜素含量顯著正相關(guān)(表4);蒸騰速率與氣孔導(dǎo)度的相關(guān)系數(shù)為0.862，達(dá)極顯著水平.巖白菜素含量與凈光合速率及葉綠素含量正相關(guān)，其中與凈光合速率的相關(guān)性達(dá)顯著水平，與總?cè)~綠素含量達(dá)極顯著水平;沒食子酸算含量則與各個(gè)參數(shù)的相關(guān)性都不顯著.

表5 光合參數(shù)與有效成分的相關(guān)系數(shù)表

4 小結(jié)與討論

由于本研究的9個(gè)居群虎耳草均經(jīng)過2～3年時(shí)間的移栽處理，基本排除了原生境因素對不同居群虎耳草光合特性及有效成分含量比較的干擾，這種差異的造成應(yīng)屬居群本身遺傳差異導(dǎo)致.9個(gè)虎耳草居群從外部形態(tài)到光合生理及有效成分含量均存在較大差異，其中湖南祁陽居群的凈光合速率最大，但其葉綠素含量并不是最高的，說明葉綠素含量并不是影響光合作用的唯一因素.湖南中方仙人谷居群葉綠素a/b值最小，表明該虎耳草葉片對光強(qiáng)適應(yīng)程度最不敏感.

藥用植物有效成分積累與其生理生態(tài)因子的關(guān)系密切.賈光林等對人參中人參皂苷與生態(tài)因子的相關(guān)性分析結(jié)果表明，熱量因子對人參皂苷活性成分的累積起主要作用[15].本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同光溫種植條件下，虎耳草巖白菜素及沒食子酸含量與光合有效輻射呈正相關(guān)[16].綠色植物通過光合作用產(chǎn)生的初生代謝產(chǎn)物，既是植物生命活動必需的化合物，又是植物次生代謝產(chǎn)物的前體，并且所有旺盛生長的細(xì)胞內(nèi)都存在著次生代謝物的不斷合成和轉(zhuǎn)化[17].本試驗(yàn)通過對9個(gè)居群虎耳草的光合參數(shù)及有效成分含量相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，巖白菜素含量與凈光合速率顯著正相關(guān)，與總?cè)~綠素含量相關(guān)系數(shù)為0.837，達(dá)極顯著正相關(guān)，但沒食子酸含量與光合參數(shù)的相關(guān)性均不顯著，其原因可能是這兩種成分在虎耳草植株內(nèi)合成途徑不同所導(dǎo)致.

[1]中國植物志編輯委員會.中國植物志(第34 (2)卷)[M].北京:科學(xué)出版社，2005:75.

[2]覃容貴，龍慶德，范菊娣，等.炮制對虎耳草中巖白菜素及其止咳抗炎作用的影響[J].中成藥，2013，35(5):1027-1030.

[3]羅厚慰，吳葆金，陳節(jié)庵，等.虎耳草有效成分的研究[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1988，19 (1):1-3.

[4]Chen Z，Liu Y-M，Yang S，et al.Studies on the chemical constituents and anticancer activity of Saxifraga stolonifera (L.) Meeb[J].Bioorganic ＆Medicinal Chemistry.2008 (16):1337-1344.

[5]丁家欣，張秋海，張玲，等.HPLC 法測定不同產(chǎn)地與采收期虎耳草中巖白菜素的含量[J].中國中藥雜志，2002，27 (10):792-793.

[6]黃志金，趙楊，趙超，等.虎耳草根、莖、葉中巖白菜素的含量研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(2):86-88.

[7]周欣，陳華國，黃志金，等.虎耳草抗前列腺癌生物活性部位篩選研究[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2013，29(6):867-870.

[8]周美，陳華國，先春，等.虎耳草乙酸乙酯部位高效液相色譜指紋圖譜研究[J].中國中藥雜志，2013，38(7):1026-1029.

[9]周欣，陳華國，黃志金，等.響應(yīng)面法優(yōu)選虎耳草抗前列腺癌活性部位提取工藝[J].中草藥，2013，44(13):1768-1773.

[10]張新華，夏念和.含笑屬(木蘭科)植物花粉形態(tài)及其系統(tǒng)學(xué)意義[J].廣西植物，2008，28 (3):311-316.

[11]全妙華，歐立軍，佘朝文，等.中國石蒜屬種間關(guān)系的trnH-psbA 序列分析[J].園藝學(xué)報(bào)，2011，38(8):1589-1594.

[12]曾苗春，左浪柱，賀安娜.不同居群虎耳草形態(tài)性狀遺傳多樣性研究[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2013(9):38-39.

[13]李六林，楊佩芳，田彩芳.新紅星蘋果不同枝類葉片中葉綠素含量的變化[J].果樹科學(xué)，1999，16(1):78-80.

[14]張錦春，趙明，張應(yīng)昌，等.灌溉植被梭梭、白刺光合蒸騰特性及影響因素分析[J].西北植物學(xué)報(bào)，2005，25 (1):70-76.

[15]賈光林，黃林芳，索風(fēng)梅，等.人參藥材中人參皂苷與生態(tài)因子的相關(guān)性及人參生態(tài)區(qū)劃[J].植物生態(tài)學(xué)報(bào)，2012，36 (4):302-312.

[16]賀安娜，歐立軍，李勝華，等.虎耳草不同光溫條件下光合特性及有效成分含量的相關(guān)性分析[J].植物研究，2013，33 (5):587-592.

[17]McMullen M D，Byrne P F，Snook M E.et al.Quantitative trait loci and metabolic pathways[J].Proc Natl Acad Sci USA，1998 (95):1996-2000.