李洪波，郭祥前，陳 靜，龍 騰，張子政

(懷化學(xué)院1.生命科學(xué)系;2.民族藥用植物資源研究與利用湖南重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 懷化 418008)

β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)學(xué)名為β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，常用名為乳糖酶，廣泛存在于各種動(dòng)物、植物、微生物中，可催化乳糖分解成一分子的葡萄糖和一分子的半乳糖[1，2].利用乳糖酶水解乳制品中的乳糖，可將乳糖含量降低70%-80%，解決乳糖不耐癥患者的乳品消費(fèi)問(wèn)題[2-4].熱穩(wěn)定性好的β-半乳糖苷酶具有較高的開(kāi)發(fā)價(jià)值，目前多數(shù)耐熱β-半乳糖苷酶的最適溫度在60℃以上，高溫下熱穩(wěn)定性良好，能夠有效降低生產(chǎn)工藝中微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)[5].嗜熱β-半乳糖苷酶主要來(lái)源于高溫菌，已有許多研究報(bào)道表明通過(guò)基因重組技術(shù)，將嗜熱β-半乳糖苷酶基因?qū)脒m合的宿主細(xì)胞，可以高效地產(chǎn)生熱穩(wěn)定性好的重組β-半乳糖苷酶[6-8].碳源是影響重組蛋白在組成型畢赤酵母中分泌表達(dá)水平的最主要因素.本研究分別以葡萄糖、果糖、丙三醇、乳糖、蔗糖、麥芽糖六種碳源，分析碳源對(duì)組成型重組酵母分泌表達(dá)源自嗜熱菌Pyrococcus furiosuβ-半乳糖苷酶的影響，確定組成培養(yǎng)基的最佳碳源.

1 材料與方法

1.1 材料

表達(dá)嗜熱菌Pyrococcus furiosuβ-半乳糖苷酶的組成型畢赤酵母轉(zhuǎn)化子由佛羅里達(dá)大學(xué)李侍武教授饋贈(zèng)，胰蛋白胨及酵母提取物購(gòu)自O(shè)XIOD公司，YP 液體培養(yǎng)基包含1%酵母提取物和2%蛋白胨(添加1.8%瓊脂即為YP 固體培養(yǎng)基).鄰-硝基酚-β-D-半乳糖苷 (ONPG)、考馬斯亮藍(lán)G-250 及小牛血清(BSA)購(gòu)自Sigma公司.葡萄糖、丙三醇、果糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.2 方法

1.2.1 碳源對(duì)菌體生長(zhǎng)速度的影響

將重組酵母轉(zhuǎn)接至含2%葡萄糖的YP 固體培養(yǎng)基平板活化，28℃培養(yǎng)3 d，挑取重組酵母轉(zhuǎn)化子單菌落接種至含2%葡萄糖的YP 液體培養(yǎng)基中，28℃、200 rpm 培養(yǎng)36 h.按2%的接種量分別接至含2%以下6種碳源的YP 液體培養(yǎng)基中:葡萄糖、丙三醇、果糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖，28℃、200 rpm 搖床培養(yǎng)4 d，每24 h 取樣一次.測(cè)定在λ =600 nm 處測(cè)定待測(cè)液菌體濃度.設(shè)畢赤酵母出發(fā)菌株在果糖中的培養(yǎng)為對(duì)照.

1.2.2 碳源對(duì)重組酵母分泌蛋白的影響

分別取在不同碳源條件下的發(fā)酵液上清，以牛血清白蛋白為標(biāo)品，采用Bradford 法測(cè)定蛋白濃度，蛋白濃度測(cè)定方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行[9].

1.2.3 測(cè)定相對(duì)酶活

采用鄰硝基苯酚法測(cè)定酶活，參照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[9]，分別取樣品上清100 μL，快速加入1.4 mL 0.25% ONPG溶液，立即搖勻?qū)悠分糜?5℃水浴鍋中水浴3 min.立即加入0.5 mL NaCO3溶液終止反應(yīng).空白對(duì)照為加入待測(cè)液后先加入NaCO3溶液，后加入ONPG 溶液，同樣水浴3 min 后，以空白為對(duì)照，在分光光度計(jì)λ =420 nm 處測(cè)定各樣品的OD值.以酵母出發(fā)菌株在2%葡萄糖的YP 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌液上清為對(duì)照.

1.2.4 目標(biāo)蛋白的SDS-PAGE 分析

取不同碳源在不同培養(yǎng)時(shí)間下的重組酵母發(fā)酵液上清液TCA 沉淀后，100%乙醇洗滌蛋白沉淀3次，含8 M 尿素的PBS 溶解蛋白沉淀，加入SDS 上樣緩沖液，煮沸熱變性5 min，12% SDS-PAGE 電泳分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)菌體生長(zhǎng)速度的影響

不同碳源下菌體生長(zhǎng)曲線如圖1所示，丙三醇中的酵母菌體濃度最高，麥芽糖最低.丙三醇中的酵母第1 d 即進(jìn)入對(duì)數(shù)期，第2-4 d 維持在穩(wěn)定期，菌體濃度在培養(yǎng)4 d 時(shí)為各碳源最高;果糖、葡萄糖及丙三醇的菌體生長(zhǎng)曲線趨同.以蔗糖、乳糖及麥芽糖為碳源，培養(yǎng)2 d 內(nèi)處于停滯期，之后進(jìn)入對(duì)數(shù)期;以蔗糖為碳源于第3 d 進(jìn)入穩(wěn)定期，以麥芽糖和乳糖為碳源，培養(yǎng)4 d 后仍處于菌體生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期.菌體生長(zhǎng)曲線說(shuō)明，單糖和丙三醇為碳源，菌體的生長(zhǎng)明顯快于雙糖，當(dāng)以乳糖和麥芽糖為碳源時(shí)菌體生長(zhǎng)的停滯期和以數(shù)生長(zhǎng)期最長(zhǎng).出發(fā)菌株在果糖中的生長(zhǎng)曲線和菌體濃度與重組酵母在果糖中的情況基本一致.在不同碳源中，重組酵母菌的菌體生長(zhǎng)情況是:丙三醇＞果糖＞葡萄糖＞蔗糖＞麥芽糖＞乳糖.

圖1 不同碳源下酵母的菌體生長(zhǎng)曲線

2.2 碳源對(duì)重組酵母分泌目標(biāo)蛋白的影響

不同碳源培養(yǎng)的培養(yǎng)基上清中的總蛋白濃度如圖2所示，以葡萄糖、果糖和丙三醇為碳源，酵母分泌的總蛋白在第2 d 迅速上升，之后維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平;乳糖在1-2 d 蛋白濃度較低，而3-4 d 總蛋白濃度迅速上升，并與上述3種碳源達(dá)相近水平.以麥芽糖和蔗糖為碳源時(shí)，發(fā)酵液中的總蛋白濃度在4 d 內(nèi)均處于較低水平.菌體分泌蛋白的曲線說(shuō)明，單糖和丙三醇為碳源菌體，發(fā)酵液中的總蛋白濃度較高，重組酵母菌分泌蛋白的能力在3種碳源中相近，當(dāng)以乳糖為碳源，在培養(yǎng)的第4 d 達(dá)到與以上3種碳源接近的水平，當(dāng)以麥芽糖和蔗糖為碳源時(shí)在培養(yǎng)時(shí)間范圍內(nèi)，重組酵母轉(zhuǎn)化子僅能分泌少量蛋白.

圖2 不同碳源下樣品的總蛋白濃度

2.3 碳源對(duì)重組酵母分泌β-半乳糖苷酶酶活的影響

由圖3可知，除畢赤酵母出發(fā)菌株的酶活始終很低外，6種碳源都能使重組酵母分泌β-半乳糖苷酶.在培養(yǎng)的第1 d，葡萄糖為碳源酶活最高，而第2 d 果糖為最高;果糖的酶活在第4 d 有所下降，葡萄糖從3 d 開(kāi)始，酶活稍有下降;以丙三醇為碳源，在培養(yǎng)的4 d 內(nèi)，酶活一直在增加，但其酶活要低于果糖和葡萄糖.當(dāng)以蔗糖、麥芽糖和乳糖雙糖為碳源時(shí)，酶活在培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)始終處于較低水平，且總體穩(wěn)定，沒(méi)有明顯增加.酶活測(cè)定結(jié)果表明，果糖是6種碳源中最好的碳源，其次是葡萄糖和丙三醇;蔗糖、麥芽糖和乳糖雙糖在培養(yǎng)重組酵母時(shí)，其分泌的β-半乳糖苷酶酶活較低.

圖3 不同碳源下β-半乳糖苷酶的相對(duì)酶活力

圖4 不同碳源下目標(biāo)蛋白的SDS-PAGE 圖譜

2.4 不同碳源對(duì)重組酵母分泌目標(biāo)蛋白的SDS-PAGE 分析

重組嗜熱菌Pyrococcus furiousβ-半乳糖苷酶的分子量大約為60 kDa，出發(fā)菌株以果糖為碳源的蛋白分泌和重組酵母菌株在6種碳源中的蛋白分泌情況的SDS-PAGE 結(jié)果如圖4所示.從SDS-PAGE 結(jié)果可以看出，出發(fā)菌株以果糖為碳源其培養(yǎng)基上清0、1、2、3、4 d 樣品在目標(biāo)位置未出現(xiàn)明顯的特異蛋白條帶;當(dāng)以果糖為碳源時(shí)，其培養(yǎng)基上清在培養(yǎng)前沒(méi)有特異條帶，在培養(yǎng)的1、2、3、4 d 中，60 kDa 處出現(xiàn)特異蛋白條帶，該條帶在培養(yǎng)的第1 d 就已經(jīng)非常明顯;當(dāng)以葡萄糖為碳源時(shí)，其培養(yǎng)基上清在培養(yǎng)前沒(méi)有特異條帶，在培養(yǎng)的1、2、3、4 d 中，60 kDa 處出現(xiàn)特異蛋白條帶，該條帶在培養(yǎng)的第1 d 就已經(jīng)較明顯并持續(xù)增加到第4 d;當(dāng)以丙三醇為碳源時(shí)，其培養(yǎng)基上清在培養(yǎng)前沒(méi)有特異條帶，在培養(yǎng)后，60 kDa 處出現(xiàn)特異蛋白條帶，該條帶在培養(yǎng)的第1 d 就已經(jīng)較明顯并持續(xù)加到第4 d;當(dāng)以蔗糖、麥芽糖和乳糖雙糖為碳源時(shí)，60 kDa 處出現(xiàn)特異蛋白條帶，但始終較弱.SDS-PAGE的檢測(cè)結(jié)果與酶活測(cè)定結(jié)果基本吻合.SDS-PAGE 結(jié)果同樣表明，以單糖和丙三醇為碳源時(shí)，β-半乳糖苷酶的分泌不平要明顯高于雙糖.

3 討論

目前，商用乳糖酶以耐熱性較差的胞內(nèi)酶為主，這些胞內(nèi)酶的產(chǎn)率低并且分離純化過(guò)程比較復(fù)雜，使得商業(yè)用乳糖酶的市場(chǎng)價(jià)格較昂貴.從食品安全性考慮，在乳業(yè)生產(chǎn)上加入低溫酶容易引起污染，存在食品質(zhì)量安全隱患.耐高溫乳糖酶在100℃經(jīng)幾十分鐘甚至數(shù)小時(shí)熱處理仍保持很高的活性，并且在高溫條件下，乳糖更易水解.牛乳消毒主要采用巴氏消毒法或高溫瞬時(shí)消毒法，耐高溫酶在上述消毒甚至滅菌條件下仍能滿(mǎn)足去除乳糖的要求，耐高溫乳糖酶的產(chǎn)業(yè)化前景廣闊[10-13].本研究主要分析碳源對(duì)組成型重組酵母分泌源自嗜熱菌Pyrococcus furiosuβ-半乳糖苷酶的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組畢赤酵母在不同碳源下分泌表達(dá)重組β-半乳糖苷酶的能力存在明顯差異，并得出6種碳源中果糖為酵母產(chǎn)β-半乳糖苷酶的最佳碳源，葡萄糖、丙三醇次之，且單糖碳源要優(yōu)于雙糖，畢赤酵母生長(zhǎng)與β-半乳糖苷酶合成同步，在生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期酶活力最高.

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