顏為海，趙清霞，陳紅巖

(1.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遺傳工程國家重點實驗室，上海 200433)2.上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司，上海 200131;3.和卓生物科技(上海)有限公司，上海 200000)

靶向藥物是根據(jù)腫瘤細(xì)胞中分子的生物學(xué)特征與正常細(xì)胞中分子生物學(xué)特征的區(qū)別而研發(fā)的藥物，是隨著當(dāng)代分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展而產(chǎn)生的高科技藥物.目前靶向藥物，尤其是抗體類藥物在當(dāng)下社會已經(jīng)得到廣泛的認(rèn)可和應(yīng)用.抗體類藥物具有特異性高、毒副作用小、均一性好、靶向明確等優(yōu)點［1－2］.在各種疾病的治療或臨床試驗中，特別是腫瘤的治療中，已有多種抗體藥物被應(yīng)用，到目前為止，處于臨床前和臨床研究及開發(fā)的抗體類藥物已有約500多種［3－7］.

隨著抗體類藥物在疾病治療或臨床試驗中的應(yīng)用，尤其是人源化抗體的應(yīng)用以及噬菌體展示技術(shù)的出現(xiàn)，抗體類藥物的興起和發(fā)展將會成為疾病治療的趨勢，因此抗體類藥物的高通量生產(chǎn)將成為必然.研發(fā)抗體類藥物的機構(gòu)和企業(yè)急需一個可以小規(guī)模高通量表達(dá)抗體蛋白的平臺，而瞬時表達(dá)系統(tǒng)可在短時間內(nèi)獲得可供研究的抗體樣品，在抗體藥物研發(fā)的早期階段非常適用.

作者馴化HEK293 PEAK細(xì)胞適應(yīng)無血清懸浮培養(yǎng)，獲得可供實驗研究的細(xì)胞株，用一種聚合物PEI將抗體基因轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中表達(dá)出具有生物活性的抗體蛋白，成功建立無血清懸浮培養(yǎng)HEK293 PEAK細(xì)胞的瞬轉(zhuǎn)快速表達(dá)抗體蛋白平臺.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 細(xì)胞與質(zhì)粒

HEK293 PEAK細(xì)胞購自ATCC;表達(dá)載體:已構(gòu)建好的抗體輕重鏈質(zhì)粒由作者單位實驗室贈送.

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

Gibco?FreeStyleTM293表達(dá)培養(yǎng)液購自Invitrogen公司;EX－cell培養(yǎng)液購自Sigma公司;PEI購自Sigma公司;蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品購自Fermentas公司.

1.2 方 法

1.2.1 HEK293 PEAK細(xì)胞無血清懸浮培養(yǎng)馴化

將HEK293 PEAK細(xì)胞采用EX－cell培養(yǎng)液和Gibco?FreeStyleTM293表達(dá)培養(yǎng)液兩種培養(yǎng)液進行馴化培養(yǎng)，每天記錄細(xì)胞密度，計算細(xì)胞活率，以及觀測細(xì)胞生長狀態(tài)的變化.將馴化好的HEK293 PEAK細(xì)胞采用有限稀釋法在96孔板中篩選亞克隆，挑選并建立抗體瞬轉(zhuǎn)表達(dá)工程細(xì)胞株.

1.2.2 抗體瞬轉(zhuǎn)表達(dá)條件優(yōu)化及抗體蛋白表達(dá)

將構(gòu)建好的能夠表達(dá)抗體Herceptin的輕重鏈表達(dá)載體(p－antibody－h(huán)eavy chain和p－antibodylight chain)(作者實驗室保存)，用轉(zhuǎn)染試劑PEI轉(zhuǎn)染到建立好的HEK293 PEAK瞬轉(zhuǎn)表達(dá)工程細(xì)胞株中.實驗中優(yōu)化了轉(zhuǎn)染試劑PEI與質(zhì)粒DNA量的比例，將PEI與DNA(GFP表達(dá)質(zhì)粒)的比例設(shè)置為1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1，然后進行轉(zhuǎn)染，72 h 后在熒光顯微鏡下觀察，計數(shù)表達(dá) GFP 熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)及轉(zhuǎn)染細(xì)胞活率.在確定質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑PEI的比例后，將構(gòu)建好的對照抗體輕重鏈的表達(dá)載體用PEI共轉(zhuǎn)入瞬轉(zhuǎn)表達(dá)工程細(xì)胞株HEK293 PEAK細(xì)胞中，每天記錄細(xì)胞活率和活細(xì)胞數(shù)，每天離心收集上清液用ELISA檢測抗體蛋白的表達(dá)量［8－12］.

1.2.3 抗體蛋白的純化及活性的初步分析

將收獲的細(xì)胞培養(yǎng)上清液經(jīng)ProteinA層析柱一步純化.首先用10倍柱體積的結(jié)合緩沖液(0.1 M Tris/0.15 M NaCl，pH 7.5)平衡層析柱，至 OD280＜0.02.然后將離心收集并經(jīng) 0.22 μm 濾器過濾后的細(xì)胞上清液，泵入層析柱(速率為1 mL·min－1).上樣完畢后再用結(jié)合緩沖液(0.1 M Tris/0.15 M NaCl，pH 7.5)平衡層析柱，至少 10 個柱體積，至 OD280＜0.02.最后加入洗脫緩沖液(0.1 M Gly/0.15 M NaCl，pH 2.8)，約10 個柱體積.用1.5 mL EP 管收集洗脫的樣品，1.0 mL/管，每個 EP 管內(nèi)需預(yù)先加入中和緩沖液(1 M Tris，pH 8.0)100 μL.測OD值，取OD值最高及OD值與最高值相差不到一個數(shù)量級的樣品管，收集，合并.并用4% ～12%SDS－PAGE梯度蛋白電泳膠進行分析.將洗脫的抗體樣品在PBS緩沖液中透析過夜后定量，分裝凍存?zhèn)溆?

將純化好的抗體蛋白進行還原和非還原SDS－PAGE膠分析;為了驗證經(jīng)過馴化的HEK293 PEAK細(xì)胞轉(zhuǎn)染后表達(dá)的抗體蛋白是否具有生物學(xué)活性，采用基于CCK－8的細(xì)胞抑制增殖實驗對收獲的抗體蛋白進行生物活性初步分析.采用人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞BT474作為癌癥靶細(xì)胞，BT474為Her2高表達(dá)細(xì)胞，能與抗體 Herceptin 特異性結(jié)合［13－15］.將靶細(xì)胞鋪在 96 孔板中，15 000 cells·well－1，設(shè)置 3 復(fù)孔，加連續(xù)稀釋的不同濃度的抗體作用72 h后，加入CCK－8，孵育4 h后在450 nm處讀取吸光值，測定細(xì)胞活力，確定抗體抑制腫瘤細(xì)胞的活性.

2 結(jié)果

2.1 HEK293 PEAK細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中的懸浮馴化培養(yǎng)

采用EX－cell培養(yǎng)液和Gibco?FreeStyleTM293表達(dá)培養(yǎng)液兩種培養(yǎng)液對HEK293 PEAK細(xì)胞進行懸浮馴化培養(yǎng).圖1為HEK293 PEAK細(xì)胞在EX－cell培養(yǎng)液和Gibco?FreeStyleTM293表達(dá)培養(yǎng)液兩種培養(yǎng)液馴化培養(yǎng)的生長變化情況.在EX－cell培養(yǎng)液中HEK293 PEAK細(xì)胞隨著培養(yǎng)時間的增長，細(xì)胞活率逐漸下降，活細(xì)胞數(shù)增長緩慢;在Gibco?FreeStyleTM293表達(dá)培養(yǎng)液中HEK293 PEAK細(xì)胞隨著培養(yǎng)時間的增長，細(xì)胞活率先下降后逐漸恢復(fù)，活細(xì)胞數(shù)在活率恢復(fù)后明顯上升.結(jié)果表明HEK293 PEAK細(xì)胞更適合在無血清Gibco?FreeStyleTM293表達(dá)培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng).

圖1 用EX－cell培養(yǎng)液(A)和Gibco?FreeStyleTM293表達(dá)培養(yǎng)液(B)馴化的HEK293 PEAK細(xì)胞生長變化曲線Fig.1 The growth curves of HEK293 PEAK cells in EX－cell medium(A)and Gibco? FreeStyleTM293 expression medium(B)

2.2 抗體瞬轉(zhuǎn)表達(dá)條件優(yōu)化結(jié)果及抗體蛋白表達(dá)

將 PEI與 DNA 的比例設(shè)置為1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1，通過與 GFP 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染 72 h 后在熒光顯微鏡下觀察并統(tǒng)計表達(dá)熒光蛋白GFP的細(xì)胞數(shù)，計算轉(zhuǎn)染效率和活率.如表1所示，當(dāng)PEI∶DNA為2∶1時，轉(zhuǎn)染效率以及細(xì)胞活率最為理想.抗體輕重鏈的表達(dá)載體用PEI瞬轉(zhuǎn)入瞬轉(zhuǎn)表達(dá)工程細(xì)胞系HEK293 PEAK細(xì)胞后，第6天后活率明顯下降，蛋白表達(dá)量也在第6天達(dá)到最高，為75.9 mg·L－1.

表1 不同PEI與DNA的比例轉(zhuǎn)染效率以及轉(zhuǎn)染72 h后活率Tab.1 72 h post－transfection efficiency and cell viability with PEI and DNA in different proportions

圖2為抗體重鏈和抗體輕鏈表達(dá)質(zhì)粒圖譜.圖3為轉(zhuǎn)染后細(xì)胞活率和活細(xì)胞數(shù)的變化以及每天的蛋白表達(dá)量.結(jié)果表明質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑的比例為1∶2時，轉(zhuǎn)染效率最佳，瞬時轉(zhuǎn)染到第6天，抗體表達(dá)量最高.

圖2 抗體重鏈(A)及輕鏈(B)質(zhì)粒圖譜Fig.2 The plasmid maps of p－antibody－h(huán)eavy chain and p－antibody－light chain(B)

圖3 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞活率和活細(xì)胞數(shù)的變化以及蛋白的表達(dá)量Fig.3 The growth curves(A)and the antibody expression(B)of HEK293 PEAK cells after transient transfection

2.3 表達(dá)純化抗體的純度及活性初步分析

2.3.1 抗體SDS－PAGE凝膠電泳結(jié)果

瞬轉(zhuǎn)表達(dá)的抗體蛋白經(jīng)ProteinA一步純化后，進行SDS－PAGE凝膠電泳分析純度.如圖4所示，非還原性條件得到一個條帶，約為150 kD，與抗體分子量相符合;還原性條件得到2個條帶分別為50 kD和25 kD，分別與抗體輕、重鏈的分子量相符合.

2.3.2 抗體活性分析結(jié)果

瞬轉(zhuǎn)表達(dá)的抗體蛋白經(jīng)ProteinA一步純化后進行活性分析，基于CCK－8的細(xì)胞抑制增殖實驗，15 000 cells·well－1，加抗體作用72 h后，加入CCK－8測定細(xì)胞活力，圖5為表達(dá)純化的抗體蛋白和對照抗體Herceptin所做的活性分析結(jié)果.

圖4 抗體蛋白SDS－PAGE結(jié)果Fig.4 The SDS－PAGE gel result

圖5 抗體蛋白活性分析結(jié)果Fig.5 The biological activity of antibody

由圖5可知，對照抗體抑制腫瘤細(xì)胞增殖的IC50=0.138 3 μg·mL－1，表達(dá)的檢測抗體抑制腫瘤細(xì)胞增殖的IC50=0.151 2 μg·mL－1，二者抑制瘤細(xì)胞增殖活性在檢測誤差范圍內(nèi)，從圖中可以看到瞬轉(zhuǎn)表達(dá)的抗體蛋白與對照抗體Herceptin的活性基本相當(dāng)，表達(dá)抗體的生物活性符合要求.

3 討論

現(xiàn)在抗體藥物發(fā)展飛速，能夠快速獲得具有治療價值的抗體，并對其進行有效性和安全性評價的前提就是獲得表達(dá)的抗體蛋白.瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)由于目的基因不需要整合到宿主的基因組中，基因拷貝數(shù)和轉(zhuǎn)染效率均相對穩(wěn)定，可在短時間內(nèi)獲得可供研究的抗體樣品，從而在抗體藥物研發(fā)的早期非常適用.

瞬時表達(dá)常用的轉(zhuǎn)染試劑為PEI，是一種陽離子聚合物，是近年發(fā)展迅速的高效非病毒載體之一，具有經(jīng)濟實惠、轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性低、轉(zhuǎn)染方法操作簡單、轉(zhuǎn)染的重復(fù)性好等優(yōu)點，培養(yǎng)基可含或不含血清，可以用PBS或不含血清的培養(yǎng)基稀釋DNA進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染過程中不需換液，適用于大多數(shù)常用細(xì)胞系.

目前用于抗體表達(dá)的工程細(xì)胞株主要有CHO、BHK、Vero、HEK293等［16］，這些細(xì)胞株大多數(shù)更適合穩(wěn)轉(zhuǎn)表達(dá)抗體.穩(wěn)轉(zhuǎn)表達(dá)雖然產(chǎn)量高，但耗時太長，不適合高通量小規(guī)模表達(dá)抗體.而HEK293 PEAK細(xì)胞為野生的HEK293 PEAK細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)了SV40 T抗原以及EBNA1(Epstein－Barr nuclear antigen)蛋白，可以分別在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制含有SV40復(fù)制子和EBV(Epstein－Barr virus)復(fù)制子的質(zhì)粒［17－18］，這樣可以大幅度提高瞬轉(zhuǎn)的表達(dá)量，而且適用各種蛋白的不同表達(dá)方式.HEK293 PEAK細(xì)胞生長快，貼壁不牢，可以在無鈣離子環(huán)境下生長，易于馴化為可無血清懸浮培養(yǎng).

將HEK293 PEAK細(xì)胞馴化為無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)利于瞬轉(zhuǎn)蛋白表達(dá)，而且培養(yǎng)基中不含血清，從而減化后期純化工藝.國外商業(yè)化的工程細(xì)胞株均有專利保護，使用價格昂貴，作者成功馴化建立一株適合抗體研究的無血清懸浮培養(yǎng)的HEK293 PEAK細(xì)胞株，瞬轉(zhuǎn)后表達(dá)量達(dá)到75 mg·L－1，可以滿足后續(xù)抗體分析研究的需求，成功建立了成本低廉、快速高效、便于操作、方便抗體高通量瞬時小規(guī)模表達(dá)的平臺.

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