周麗洪，韓 陽，楊 俊，李 淼，姬廣海

(云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，云南昆明 650201)

水稻細菌性條斑病(bacterial leaf streak，簡稱BLS)是由Xanthomonas oryzae pv.oryzicola(Xoc)侵染引起的細菌性病害.1918年，Reinking［1－2］首先報道了菲律賓水稻上發(fā)生的細菌性條斑病.1955年在我國廣東省首次發(fā)現(xiàn)該?。?］.1957年方中達等［4］做了病原菌鑒定，并將該病害命名為水稻條斑病，其病原菌命名為稻生黃單胞菌(Xanthomonas oryzicola n.sp.Fang et al).該病是目前威脅我國南方稻區(qū)水稻生產(chǎn)的重要病害，也是我國、美國和澳大利亞等國重要的檢疫性水稻病害［5］.該病的發(fā)生具有流行性、暴發(fā)性和毀滅性等特點，嚴重時減產(chǎn)50%以上.

植物病原菌抗藥性是植物保護領域內(nèi)一個難以解決的問題，當病原物群體中存在潛在的抗藥基因時，在藥劑選擇壓力下便會出現(xiàn)抗藥性.我國對植物病原菌抗藥性研究多針對病害抗性的監(jiān)測與生物學特性［6］，到目前為止，先后應用于植物病害的殺菌劑已達數(shù)百種之多，用藥量持續(xù)上升［7－10］.目前細菌性條斑病及水稻白葉枯病的防治主要依賴噻枯唑、鏈霉素、申嗪霉素、噻唑鋅等殺菌劑來進行病害防治［11－18］.已有研究證明煙草野火病菌、梨火疫病菌等已對鏈霉素產(chǎn)生了抗性［19－21］;2013 年，Zhang等［22］測定了中國江浙地區(qū)水稻白葉枯菌對噻唑鋅的敏感基線并得到了噻唑鋅抗性突變菌株;關(guān)于申嗪霉素等農(nóng)藥在稻田中的殘留問題也不斷被提出［23］，使用抗菌素防治病害潛在的安全性問題令人擔憂.雖然生物防治不斷被提出［24－25］，但仍然無法高效控制病害，所以對控病藥劑的研究也應該繼續(xù)深入.目前并無關(guān)于水稻條斑病菌對申嗪霉素、噻唑鋅的抗藥性的研究報道.因此，及時建立水稻細菌性條斑病菌對申嗪霉素、噻唑鋅的敏感基線以及開展抗藥性風險評價等相關(guān)研究，對該殺菌劑的田間科學使用、抗藥性監(jiān)測與治理和延長藥劑的使用壽命具有重要指導意義.

1 材料和方法

1.1 材 料

供試藥劑:1%申嗪霉素(phenazino－1－carboxylic acid)，上海樂農(nóng)生物制品股份有限公司;20%噻唑鋅(zinc thiazole)，浙江新農(nóng)化工股份有限公司.

供試菌株:2008年至2012年，從云貴川3省的條斑病發(fā)生地采集樣品.采用平板劃線分離法，對采來的標本病葉進行病原菌分離、純化、保存及致病性測定［26－27］.選取43株條斑病菌，測定各菌株對申嗪霉素及噻唑鋅的敏感性.菌株來源、數(shù)量及編號詳見表1.

表1 供試菌株及菌株來源Tab.1 The strains tested and source of strains

1.2 方 法

1.2.1 抗菌譜的測定

將在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(nutrition agar，簡稱NA)平板上生長的病原菌用滅菌移菌環(huán)移到裝有液體NB的三角瓶中，恒溫震蕩(28℃，170 r·min－1)48 h，得到菌懸液.申嗪霉素設置4個濃度梯度:將原液稀釋 10、30、50、100.噻唑鋅設置5 個濃度梯度:將原液稀釋 100、125、150、175、200 倍.

采用離體平板抑菌圈法［28－30］:在滅菌培養(yǎng)皿中加入濃度為3×108CFU(菌落形成單位，colong-forming unit)的病原菌懸液100 μL后加入培養(yǎng)基.混勻后在無菌條件下用吹風機吹干待用.在每塊平板上放置6個牛津杯(直徑0.6 cm、高1.0 cm)，用移液槍分別向每個牛津杯內(nèi)加入不同濃度的申嗪霉素或噻唑鋅藥液100 μL，對照用無菌水100 μL，然后將平板放置在28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng).各濃度設置3個重復.將平板放在恒溫箱中28℃培養(yǎng)，每天觀察一次，并記載抑菌圈的變化情況.

1.2.2 敏感基線的建立

通過測定不同藥劑濃度下的抑菌圈的直徑(mm)，計算藥劑對細菌生長的抑制率，抑制率=(抑菌圈的直徑－牛津杯直徑)/牛津杯直徑.使用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)［31］計算藥劑的有效抑制中濃度(EC50)、毒力回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r)，比較不同地區(qū)的水稻細菌性條斑病菌對申嗪霉素及噻唑鋅的敏感性，根據(jù)水稻細菌性條斑病菌的敏感性頻率分布建立水稻細菌性條斑病菌對申嗪霉素及噻唑鋅的敏感基線.將抑制率換算成機率值，將藥劑濃度換算成濃度對數(shù)，以濃度對數(shù)為橫坐標，抑制率為縱坐標，用Microsoft Office Excel軟件求出回歸方程及致死中濃度(EC50).

2 結(jié)果和分析

2.1 噻唑鋅對水稻條斑病菌的室內(nèi)抑制率測定分析

云南、貴州、四川水稻條斑病菌對噻唑鋅的敏感性測定結(jié)果顯示:不同菌株對噻唑鋅的敏感性存在顯著性差異，供試菌株 EC50值范圍在 0.439 ～2.549 μg·mL－1，平均值為 1.641 μg·mL－1.來自云南臨滄的30－1－3菌株噻唑鋅敏感性最低，其EC50值為2.549 μg·mL－1;來自云南瑞麗的菌株20－4－1，噻唑鋅敏感性最高，其EC50值為0.439 μg·mL－1;敏感性最高和最低菌株的EC50值相差5.806倍，且均來自于云南省低海拔高緯度的延邊地區(qū)，說明云南省條斑病菌株對噻唑鋅敏感性涵蓋范圍最廣，云南省條斑病菌噻唑鋅抗性豐富度最高(表2).

表2 噻唑鋅對供試菌株的EC50值Tab.2 The EC50value of the strains to zinc thiazole

不同地區(qū)菌株群體對噻唑鋅的敏感性測定結(jié)果顯示:不同地區(qū)菌株的EC50差異性顯著.其中云南紅河的菌株對噻唑鋅的敏感性最低，即EC50均值最大，為1.986 μg·mL－1;四川西昌的菌株對噻唑鋅的敏感性最高，EC50均值最低，為 1.458 μg·mL－1;云南省菌株 EC50值涵蓋范圍最廣，為 0.439 ～ 2.549 μg·mL－1，其中也包含了噻唑鋅敏感性最低和最高的菌株，說明了云南省菌株對噻唑鋅抗性的多樣性較四川和貴州更豐富;四川西昌的菌株對噻唑鋅的敏感性最高，即西昌地區(qū)的條斑病菌株對噻唑鋅的抗性較低，表明噻唑鋅可以繼續(xù)用于西昌條斑病的防控;同理噻唑鋅則不太適合繼續(xù)用于云南紅河州、德宏州、楚雄州等地區(qū)條斑病的防控(表3).

表3 各地區(qū)菌株群體對噻唑鋅的EC50均值比較Tab.3 The EC50value of the strains from different regions to zinc thiazole

2.2 申嗪霉素對水稻條斑病菌的室內(nèi)抑制率測定分析

云南、貴州、四川水稻條斑病菌對申嗪霉素的敏感性測定結(jié)果顯示:不同菌株對申嗪霉素的敏感性存在顯著性差異，供試菌株 EC50值范圍在 0.035 ～1.598 μg·mL－1，平均值為 0.868 μg·mL－1.來自云南臨滄的菌株21－1－1對申嗪霉素敏感性最低，其EC50值為1.598 μg·mL－1;來自四川鹽邊的菌株細66對申嗪霉素敏感性最高，其EC50值為0.035 μg·mL－1;申嗪霉素敏感性最高和最低菌株的EC50值相差45.657倍;以上結(jié)果顯示，云南臨滄可能已經(jīng)出現(xiàn)申嗪霉素抗性菌株，也表明申嗪霉素目前仍適用于四川延邊條斑病的防控，卻不再適用于云南臨滄是、瑞麗市、德宏州等地區(qū)條斑病的防控(表4).

表4 申嗪霉素對供試菌株的EC50值Tab.4 The EC50value of the strains to phenazino－1－carboxylic acid

續(xù)表4

不同地區(qū)菌株群體對申嗪霉素的敏感性測定結(jié)果顯示:不同地區(qū)菌株的EC50差異性顯著.其中云南紅河的菌株對申嗪霉素敏感性最低，即EC50均值最大，為1.526 μg·mL－1;四川鹽邊的菌株對申嗪霉素敏感性最高，EC50均值最低，為0.609 μg·mL－1;云南省菌株 EC50值涵蓋范圍最廣，為 0.065 ～1.598 μg·mL－1，其中也包含了對申嗪霉素敏感性最高的菌株和敏感性偏低的菌株，說明了云南省菌株對申嗪霉素抗性的多樣性較四川和貴州更豐富;四川鹽邊的菌株對申嗪霉素的敏感性最高，即鹽邊地區(qū)的條斑病菌株對申嗪霉素的抗性較低，表明申嗪霉素可以繼續(xù)用于鹽邊條斑病的防控;同理申嗪霉素則不太適合繼續(xù)用于云南紅河州、德宏州、瑞麗市、臨滄市、玉溪市地區(qū)條斑病的防控(表5).

表5 各地區(qū)菌株群體對申嗪霉素的EC50均值比較Tab.5 The EC50value of the strains from different regions to phenazino－1－carboxylic acid

2.3 水稻細菌性條斑病菌對噻唑鋅及申嗪霉素的敏感基線的建立

作者通過平板抑菌圈法測定了云南、四川、貴州3省43個水稻條斑病菌株對新型農(nóng)藥噻唑鋅及申嗪霉素的敏感性.檢測結(jié)果顯示，不同地區(qū)的43個菌株對噻唑鋅及申嗪霉素的敏感性呈現(xiàn)連續(xù)性變化.從頻率分布看，呈現(xiàn)近似正態(tài)分布.根據(jù)野生敏感型病原群體對藥劑敏感性為正態(tài)分布的原理，確定測得的43個菌株對噻唑鋅及申嗪霉素 EC50值的平均值分別是1.641、0.868 μg·mL－1，故該研究將1.641、0.868 μg·mL－1分別作為水稻細菌性條斑病菌對噻唑鋅和申嗪霉素的敏感性基線［32］.

3 討論

病原菌對殺菌劑抗藥性的發(fā)展嚴重影響藥劑的使用效力，對于一種新殺菌劑，了解其抗性風險，可加強對新候選物的研究，從而有利于新化合物合成、新藥劑的研究開發(fā)、新產(chǎn)品的登記使用、延長藥劑使用壽命等.農(nóng)藥的大量使用和抗性菌株的出現(xiàn)，使得農(nóng)藥的抗性監(jiān)測工作被推上歷史進程.該研究通過測定云貴川3省條斑病菌株對新型農(nóng)藥噻唑鋅及申嗪霉素的敏感性，建立了西南地區(qū)水稻條斑病菌對噻唑鋅及申嗪霉素的敏感基線，分別為 1.641、0.868 μg·mL－1.

作者通過離體試驗平板抑菌圈法，測定了來自于云南、貴州、四川3省的43個水稻細菌性條斑病菌株對新型農(nóng)藥噻唑鋅及申嗪霉素的敏感性.

研究結(jié)果顯示:供試菌株對噻唑鋅的抗藥性整體高于申嗪霉素;不同地區(qū)水稻條斑病菌株對噻唑鋅的敏感性存在顯著差異，云南省條斑病菌株對噻唑鋅的敏感性涵蓋范圍最廣，說明云南省條斑病菌對噻唑鋅的抗性豐富度最高，也表明了云南省條斑病菌的多樣性豐富度最高;四川西昌的菌株對噻唑鋅敏感性最高，即西昌地區(qū)的條斑病菌株對噻唑鋅的抗性較低，表明噻唑鋅可以繼續(xù)用于西昌條斑病的防控;同理噻唑鋅則不太適合繼續(xù)用于云南紅河州、德宏州、楚雄州等地區(qū)條斑病的防控.43株供試菌株對噻唑鋅的 EC50平均值為1.641 μg·mL－1，未發(fā)現(xiàn)對噻唑鋅敏感性顯著降低的菌株，所以將1.641 μg·mL－1作為西南地區(qū)水稻細菌性條斑病菌對噻唑鋅的敏感基線，該基線的建立可作為今后田間抗藥性監(jiān)測的依據(jù)［33］.

對云南、貴州、四川水稻條斑病菌對申嗪霉素的敏感性的測定結(jié)果顯示:不同地區(qū)的菌株對申嗪霉素的敏感性同樣存在顯著性差異;云南、四川、貴州三省菌株的申嗪霉素EC50值范圍分別為:0.065～1.598、0.035 ～1.182、0.415 ～1.147 μg·mL－1，其中云南省菌株 EC50值范圍最廣，包含對申嗪霉素抗性最高和偏低的菌株，說明云南省水稻條斑病菌對申嗪霉素抗性豐富度最高.結(jié)果顯示，申嗪霉素目前仍適用于四川延邊條斑病的防控，卻不再適用于云南臨滄市、瑞麗市、德宏州等地區(qū)條斑病的防控.43株供試菌株EC50平均值為0.868 μg·mL－1，對申嗪霉素敏感性最高和最低菌株的EC50值相差45.657倍;未發(fā)現(xiàn)對噻唑鋅敏感性顯著降低的菌株，所以將0.868 μg·mL－1作為西南地區(qū)水稻細菌性條斑病菌對噻唑鋅的敏感基線，該基線的建立可作為今后田間抗藥性監(jiān)測的依據(jù)［34］。

研究植物病原菌對殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的原因和抗性機制，及時了解田間菌株的抗性情況，對有效防止或延緩對殺菌劑抗藥性的產(chǎn)生具有重要意義，此不僅可以加深對殺菌劑抗藥性的認識，還為正確提出和制定科學的抗藥性治理策略提供理論依據(jù)［35－36］.農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中應用藥劑的混用和輪換交替可以延緩抗藥性的產(chǎn)生.

研究數(shù)據(jù)顯示，對噻唑鋅及申嗪霉素兩種藥劑抗藥性最高的菌株，即EC50值最高的菌株均來自云南省臨滄市，猜測該市有過度使用噻唑鋅及申嗪霉素的可能.供試菌株是否存在多種藥劑的交互抗性尚需進一步研究.據(jù)報道，目前已發(fā)現(xiàn)3種鏈霉素抗性的機制［37－38］.但云南還未發(fā)現(xiàn)天然抗鏈霉素、噻唑鋅及申嗪霉素的水稻白葉枯和條斑菌株，也沒有關(guān)于噻唑鋅及申嗪霉素抗性機制及抗性突變菌株的相關(guān)報道，條斑病菌對各類農(nóng)藥是否具有交互抗藥性也未明確，作者課題組將針對這些問題進行深入研究.

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