吳興海+劉靖靖+王建華

摘 要： 3α-HSD（3α-hydroxysteroid dehydrogenase）是睪丸酮叢毛單胞菌在以類固醇為唯一碳源時(shí)，產(chǎn)生的一種類固醇脫氫酶，也是降解類固醇的關(guān)鍵酶。本文對(duì)睪丸酮叢毛單胞菌3α-HSD基因的調(diào)控、酶蛋白結(jié)構(gòu)與功能等生物學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行闡述，總結(jié)了3α-HSD蛋白的兩種獲得途徑：天然提取和人工誘導(dǎo)表達(dá)途徑。從技術(shù)可行性、實(shí)用性和成本控制等幾個(gè)方面，分析比對(duì)二者的優(yōu)勢(shì)和不足。介紹和展望了睪丸酮叢毛單胞菌3α-HSD在血清總膽汁酸測(cè)定、轉(zhuǎn)基因生物工程、環(huán)境或食品中類固醇類激素檢測(cè)及環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀和應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：睪丸酮叢毛單胞菌；3α-HSD；研究進(jìn)展

中圖分類號(hào)：Q939.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.06.014

睪丸酮叢毛單胞菌（Comamonas testosteroni）存在于人體胃、腸道、尿液及土壤、泥漿、水體中，是一種嚴(yán)格需氧、非發(fā)酵的革蘭氏陰性細(xì)菌。睪丸酮叢毛單胞菌由Talalay 等[1]首先從池塘泥漿中分離得到，當(dāng)其生長(zhǎng)在含有類固醇的培養(yǎng)基上或環(huán)境中存在類固醇底物誘導(dǎo)時(shí)，可產(chǎn)生多種類固醇脫氫酶和11種降解酶，其中之一是3α羥基類固醇脫氫酶（3α-hydroxysteroid dehydrogenase， 3α-HSD），一種能夠利用分解甾體類和多環(huán)芳烴類化合物作為菌體生長(zhǎng)所需要的碳源和能源的關(guān)鍵酶。

目前認(rèn)為，3α-HSD不僅是睪丸酮叢毛單胞菌在以類固醇為唯一碳源時(shí)，產(chǎn)生的一種醇脫氫酶，也是降解類固醇的關(guān)鍵酶，還廣泛地存在于原核和真核生物體內(nèi)，是人體調(diào)節(jié)性激素代謝水平的重要酶類[2-3]。1998年研究人員發(fā)現(xiàn)睪丸酮叢毛單胞菌的降解酶3α-類固醇脫氫酶在降解消化甾類物質(zhì)中起主導(dǎo)作用，并對(duì)這個(gè)基因的調(diào)控機(jī)理進(jìn)行了初步研究，認(rèn)識(shí)到3α-HSD是C19～C27類固醇分解代謝途徑中最初的酶之一[4]。在過(guò)去15年的時(shí)間里，睪丸酮叢毛單胞菌3α-HSD的結(jié)構(gòu)和調(diào)控研究得到長(zhǎng)足進(jìn)展，其作用機(jī)制和功能的奧秘被逐步揭示，在幾個(gè)關(guān)鍵領(lǐng)域的應(yīng)用研究已取得顯著成果。筆者擬就3α-HSD的研究進(jìn)展結(jié)合自身研究項(xiàng)目進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述，以期進(jìn)一步系統(tǒng)了解睪丸酮叢毛單胞菌3α-HSD的表達(dá)調(diào)控機(jī)理，為今后拓寬其在環(huán)境修復(fù)、食品安全、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)研究領(lǐng)域的應(yīng)用作以鋪墊。

1 3α-HSD的生物學(xué)特點(diǎn)

1.1 3α-HSD基因的調(diào)控

3α-HSD基因全長(zhǎng)774bp，編碼258個(gè)氨基酸的肽鏈，肽鏈分子量在26.4KD左右。3α-HSD的表達(dá)過(guò)程較為復(fù)雜，在轉(zhuǎn)錄水平受多個(gè)因子調(diào)控，從最初的負(fù)調(diào)控因子阻遏蛋白R(shí)epA、RepB和活化因子Activator，到近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的正調(diào)控因子TeiR基因和LysR基因，都對(duì)其轉(zhuǎn)錄過(guò)程起到抑制或促進(jìn)作用。

1.1.1 阻遏蛋白（RepA和RepB） 在3α-HSD基因附近有4個(gè)開(kāi)放的閱讀框架（orf l、orf 2、orf 3、orf 4），與基因的誘導(dǎo)、表達(dá)與調(diào)控密切相關(guān)。3α-HSD基因受2個(gè)阻遏蛋白（RepA和RepB）的負(fù)調(diào)控，類固醇通過(guò)阻斷阻遏蛋白與調(diào)控區(qū)的結(jié)合，誘導(dǎo)3α-HSD的表達(dá)[5]。Rep A和Rep B分別由420和78個(gè)氨基酸組成，由框架orf 2 和 orf 3編碼。Rep B可與3α-HSD mRNA的5端環(huán)狀結(jié)構(gòu)相結(jié)合，其編碼框orf 3的方向與3α-HSD方向相反。RepA識(shí)別位點(diǎn)有兩處，RepA與這2個(gè)序列結(jié)合，形成一個(gè)1.6 kb的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，阻遏了細(xì)菌RNA聚合酶與hsd A啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，從而抑制3α-HSD基因的表達(dá)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究表明，去除這2處DNA序列可顯著提高3α-HSD基因的表達(dá)，而類固醇等甾體類誘導(dǎo)劑的加入可全面抑制阻遏蛋白R(shí)epB和3α-HSD基因mRNA的結(jié)合及RepA與順式操縱子雙位點(diǎn)的結(jié)合，從而促進(jìn)3α-HSD基因的表達(dá)和翻譯過(guò)程的順利進(jìn)行。

1.1.2 正調(diào)控因子 Activator是與增強(qiáng)子或與活化因子結(jié)合區(qū)域結(jié)合的蛋白，是一種在啟動(dòng)子上可以增加轉(zhuǎn)錄起始速度的DNA結(jié)合蛋白[6]。當(dāng)活化因子與下游基因的啟動(dòng)子的活化因子結(jié)合部位結(jié)合后，就能促使更多的RNA聚合酶集聚到下游基因的啟動(dòng)子附近，提高下游基因的轉(zhuǎn)錄起始速度。研究表明，在C.testosteroni染色體上編碼3α-HSD基因上游的2.6 kb處存在activator基因，該基因全長(zhǎng)為564 bp。通過(guò)研究可以發(fā)現(xiàn)，利用睪丸酮叢毛單胞菌的activator 能提高3α-HSD/CR轉(zhuǎn)錄速率，通過(guò)將強(qiáng)啟動(dòng)子整合入C. testosteroni染色體中，使強(qiáng)啟動(dòng)子位于activator基因的上游來(lái)加強(qiáng)該細(xì)菌activator基因的表達(dá)，最終加強(qiáng)下游一系列基因表達(dá)的構(gòu)想是可行的[7-9]。

類固醇誘導(dǎo)蛋白（testosterone-inducible regulator，teiR）基因和LysR基因是近年來(lái)被研究發(fā)現(xiàn)的3α-HSD基因正調(diào)控因子[10]。2004年，一種用于降解類固醇新的睪丸酮叢毛單胞菌蛋白被研究人員發(fā)現(xiàn)，中文譯為睪丸酮誘導(dǎo)調(diào)節(jié)子[11]。TeiR序列在C末端保留了螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋 （Helix-turn -helix， HTH） 式的LuxR基因DNA結(jié)合區(qū)域。與LuxR相似蛋白相同，該蛋白與目的基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游lux盒結(jié)合后可以激活或抑制目的基因的轉(zhuǎn)錄。國(guó)內(nèi)外學(xué)者的多個(gè)研究同時(shí)表明[10-11]，在培養(yǎng)基中加入類固醇進(jìn)行誘導(dǎo)的情況下，在基因表達(dá)過(guò)程中teiR基因緊密地控制著轉(zhuǎn)錄水平，而一個(gè)teiR缺失的突變菌株無(wú)法以類固醇作為單一的碳源。值得注意的是，在teiR缺失的突變體中3α-HSD基因也失去了降解類固醇的功能。這可能是由于突變體中，睪丸酮無(wú)法與teiR N端自主誘導(dǎo)物結(jié)合區(qū)域進(jìn)行結(jié)合而不能進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)，從而抑制了睪丸酮與阻遏物結(jié)合誘導(dǎo)關(guān)鍵酶3α-HSD表達(dá)的能力，最終導(dǎo)致突變體喪失了正常的降解功能。利用反向?qū)Ρ葘?shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)teiR基因插入到teiR缺失突變體菌株后，3α-HSD基因轉(zhuǎn)錄水平得以恢復(fù)。通過(guò)以上研究不難看出，teiR基因?qū)ΣG丸酮叢毛單胞菌的酶解類固醇基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程進(jìn)行正向調(diào)控，是3α-HSD等類固醇降解基因的mRNA完全表達(dá)的重要組成原件。大腸桿菌的共轉(zhuǎn)化試驗(yàn)支持了這一觀點(diǎn)，teiR基因與帶有3α-HSD /CR基因的載體質(zhì)粒后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在共轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中3α-HSD的表達(dá)明顯高于單獨(dú)轉(zhuǎn)化的3α-HSD[11]。

2010年，繼teiR基因后，在3a-HSD / CR 基因下游3.36 kb 處又發(fā)現(xiàn)了大小為912 bp 的LysR 基因[12] （ 賴氨酸調(diào)節(jié)子） ，而其所屬LysR-類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子（LTTRs）是原核生物最大的調(diào)節(jié)子家族。LTTR TsaR 蛋白無(wú)論是處于無(wú)配體形式還是復(fù)合形式都呈現(xiàn)為一個(gè)四元結(jié)構(gòu)，與Ralstonia eutropha的CbnR，或Pseudomonas aeruginosa的LysR類調(diào)節(jié)子等明顯不同，只有LTTRs是獨(dú)特的四聚體形式。雖然3種蛋白都是頭接頭的四聚體環(huán)形，但TsaR呈現(xiàn)出一個(gè)開(kāi)放結(jié)構(gòu)，而CbnR 和 PA01-PR蛋白卻是以C末端相對(duì)連接的方式閉環(huán)。明顯的差異體現(xiàn)了LTTRs四聚體的自身靈活性，也是由于結(jié)構(gòu)上更廣闊的通用性所導(dǎo)致的結(jié)果。誘導(dǎo)物的結(jié)合能夠帶來(lái)LTTR結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，破壞封閉結(jié)構(gòu)的兩個(gè)C末端連接口。這導(dǎo)致TsaR-類蛋白結(jié)構(gòu)被迫展開(kāi)，形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，拉近彼此距離。在國(guó)內(nèi)Li等[13]的研究也證明將LysR基因可明顯提高3α-HSD的表達(dá)量。

目前，這5個(gè)已發(fā)現(xiàn)的調(diào)控因子包括兩個(gè)阻遏蛋白R(shí)epA、RepB和3個(gè)正調(diào)控因子都能夠調(diào)節(jié)3α-HSD的表達(dá)水平，但是除阻遏蛋白和活化因子之間的作用機(jī)理較為明晰外（如圖1所示），具體到5個(gè)因子之間作用關(guān)系是縱向關(guān)聯(lián)還是橫向調(diào)控，是時(shí)間關(guān)系還是空間關(guān)系都不得而知，作用原理有待于進(jìn)一步的研究。

1.2 3α-HSD酶蛋白結(jié)構(gòu)與功能

1956年，Talalay等首先證實(shí)3α-HSD是類固醇代謝途徑中最初的酶之一，以后陸續(xù)從多種細(xì)菌等原核生物及動(dòng)物、人體的真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了3α-HSD，但真核和原核3α-HSD在結(jié)構(gòu)和功能等方面都存在差異較大。它們屬于不同的蛋白質(zhì)超家族，真核3α-HSD屬于還原酶超家族[14]，而原核3α-HSD屬于短鏈脫氫酶（SDR）超家族[2，15-16]。作為SDR超家族的新成員，3α-HSD酶蛋白在與其他成員的蛋白結(jié)構(gòu)存在一定的差異、同源性較低的同時(shí)，保留了該家族的2個(gè)特征性保守序列：N-末端的SDR超家族的氨基酸指紋Gly-X-X-X-Gly序列與155～159氨基酸殘基處的保守催化模塊Tyr-X-X-X-Lys。睪丸酮叢毛單胞菌3α-HSD不僅對(duì)環(huán)境、食品中雄酮等類固醇基質(zhì)和類固醇類抗生素-梭鏈胞酸進(jìn)行降解代謝，還可以催化殺蟲(chóng)劑NKI 42255等非類固醇的醛及酮的氧化還原。3α-HSD酶蛋白有單體和雙體兩種形式，具體形式取決于濃度高低：濃度較高時(shí)，晶體結(jié)構(gòu)為同源二聚體，對(duì)雄酮、四氫可的松、脫氧膽酸的活性大體相同，當(dāng)濃度低時(shí)，二聚體解離為活性更高的單體形式，對(duì)雄酮有更高的降解活性。

2 3α-HSD蛋白的獲得途徑

從睪丸酮叢毛單胞菌中分離純化天然3α-HSD需要包含以下多個(gè)步驟：首先將培養(yǎng)好的細(xì)菌裂解粉碎后，離心除去細(xì)胞殘?jiān)恋恚缓笥昧蛩徜@沉淀上清液，并將沉淀溶解、透析后用凝膠進(jìn)行過(guò)濾層析，最后用等電聚焦電泳、親和、離子交換層析進(jìn)行純化。為了避免酶活性的迅速丟失，必須在提取和純化過(guò)程中控制活性影響因子。結(jié)合酶蛋白的特點(diǎn)，通過(guò)分析可以發(fā)現(xiàn)，這種蛋白獲得途徑主要存在3個(gè)缺陷：一是步驟繁瑣，技術(shù)難度大，對(duì)操作人員的技術(shù)熟練度要求較高；二是受制于純化過(guò)程中酶活性的丟失，酶蛋白獲得率低，天然3α-HSD分離純化成本高漲，價(jià)格昂貴，生產(chǎn)工藝的應(yīng)用及產(chǎn)業(yè)化受到極大限制；三是難以有效分離β-HSD與3α-HSD。

由于天然3α-HSD價(jià)格昂貴，其使用范圍受到了極大限制。鑒于這種情況，國(guó)內(nèi)外的研究人員將目光放到了3α-HSD的人工誘導(dǎo)合成領(lǐng)域。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程的不斷發(fā)展和成熟，以3α-HSD基因?yàn)榛A(chǔ)的融合蛋白高效原核表達(dá)系統(tǒng)的建立工作得到了充分的發(fā)展，依托于不同質(zhì)粒載體的多種單價(jià)或多價(jià)表達(dá)調(diào)控體系被開(kāi)發(fā)研制成功。眾多國(guó)內(nèi)外學(xué)者[2，17-18]在人工誘導(dǎo)3α-HSD 融合蛋白領(lǐng)域都進(jìn)行了探索，開(kāi)展了大量實(shí)驗(yàn)，利用不同的載體將各國(guó)不同來(lái)源睪丸酮叢毛單胞菌3α-HSD基因片段，在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)，都取得了很好效果。有些研究通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)并利用金屬螯合層析純化后可得到純度大于98%的人工蛋白，有些研究融合蛋白的酶比活性是對(duì)照菌的十余倍。

在實(shí)際過(guò)程中，筆者發(fā)現(xiàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，摸索優(yōu)化的表達(dá)條件和實(shí)驗(yàn)參數(shù)，建立最優(yōu)的表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)對(duì)于提高人工合成融合蛋白的效率具有直接的影響。筆者所在課題組 [19]利用分子克隆的方法擴(kuò)增與克隆睪丸酮叢毛單胞菌ATCC 11996的3α-HSD基因，構(gòu)建表達(dá)工程菌，通過(guò)優(yōu)化表達(dá)菌的最佳表達(dá)條件得到目的蛋白。通過(guò)優(yōu)化純化條件，建立了3α-HSD的60%硫酸銨沉淀-親和層析-分子篩分離的高效純化方法，可以獲得具有酶活性的純度高達(dá)99%的3α-HSD，為課題的后續(xù)研究打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

3 3α-HSD的應(yīng)用研究

3.1 用于血清總膽汁酸（total bile acids， TBA ）酶循環(huán)測(cè)定（enzymatic cycIing method）

膽汁酸是3α-HSD的作用底物之一，隨著肝功能損傷程度濃度提高，臨床上用天然3α-HSD作為工具酶來(lái)測(cè)定人血清中的總膽汁酸濃度[20]。自從20世紀(jì)70 年代由睪丸酮叢毛單胞菌中提取到高純度3α-HSD后，TBA 酶法測(cè)定逐步發(fā)展起來(lái)。第四代的TBA 酶學(xué)測(cè)定方法是酶循環(huán)測(cè)定法[21-22]，用底物和輔酶的反復(fù)反應(yīng)，使待測(cè)物的量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加，從而提高了檢測(cè)靈敏度，且反應(yīng)產(chǎn)物無(wú)污染，是一種非常有應(yīng)用前景的測(cè)定方法（圖2）。研究人員[20，23]參考日本Asahi Chemical公司的有關(guān)資料，基于用脫氫酶-輔酶體系循環(huán)底物的原理，通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，建立了靈敏度高，線性、精密度好，幾乎無(wú)干擾，血清總膽汁酸（TBA）測(cè)定的酶循環(huán)法，是一種理想的TBA測(cè)定方法。

但是，從前文可知，TBA 測(cè)定中所用的工具酶3α-HSD 均從睪丸酮叢毛單胞菌中直接提取而來(lái)，天然提取的諸多固有缺陷無(wú)法繞開(kāi)[24]。這導(dǎo)致了國(guó)內(nèi)以3α-HSD為核心成分的第四代TBA循環(huán)檢測(cè)技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，只能依靠從國(guó)外進(jìn)口的昂貴試劑，在一定程度上限制了TBA 測(cè)定的臨床推廣。目前，隨著3α-HSD人工融合蛋白的原核表達(dá)技術(shù)日臻成熟，而融合蛋白的活性與天然3α-HSD基本相同，建立以融合蛋白為工具酶的血清TBA 酶學(xué)測(cè)定法的研究仍處于空白階段，從經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值上來(lái)說(shuō)都具有可觀的發(fā)展?jié)摿?，可作為下一階段的研究熱點(diǎn)。

3.2 3α-HSD轉(zhuǎn)基因體系的建立

將外源基因?qū)氲缴锘蚪M DNA 中，并在生物體內(nèi)穩(wěn)定的遺傳，獲得具有特殊功能的生物是當(dāng)前生物基因工程的主要研究熱點(diǎn)之一。研究人員先后將3α-HSD和aiiA基因以雙基因融合載體的形式通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入煙草和水稻中，檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)和生物活性后發(fā)現(xiàn)目的蛋白含量顯著高于對(duì)照，獲得具有雙基因優(yōu)點(diǎn)的煙草和水稻新種質(zhì)[25-26]。Zhang等[27]通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將含有 3α-HSD 基因的載體導(dǎo)入到果蔗基因組DNA 中，獲得陽(yáng)性植株。對(duì)轉(zhuǎn) 3α-HSD 基因的果蔗葉片進(jìn)行 ELISA 檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明：3α-HSD 基因在轉(zhuǎn)基因果蔗基因組 DNA 中得到表達(dá)，3α-HSD 蛋白的表達(dá)量高于對(duì)照。轉(zhuǎn)基因果蔗的類固醇降解率高于對(duì)照，平均降解率達(dá) 80%左右，高于對(duì)照 25%左右。

為充分發(fā)揮3α-HSD對(duì)環(huán)境污染物中的類固醇化合物的降解作用，這些研究通過(guò)基因槍法等轉(zhuǎn)基因技術(shù)將含有 3α-HSD 基因的載體導(dǎo)入到植物基因組 DNA 中，獲得目的陽(yáng)性植株。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行類固醇降解實(shí)驗(yàn)，與理論上預(yù)期效果完全一致，實(shí)際過(guò)程中轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植物對(duì)于類固醇類物質(zhì)的降解率明顯高于陰性對(duì)照。

3.3 利用3α-HSD單克隆抗體檢測(cè)環(huán)境或食品中類固醇類激素及獸藥殘留

關(guān)于類固醇類激素檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道較多[30-31]， 主要使用的常規(guī)檢測(cè)方法有高效液相色譜法、液/質(zhì)聯(lián)用法、氣/質(zhì)聯(lián)用法等。但液/質(zhì)聯(lián)用法高昂的儀器和維護(hù)保養(yǎng)成本高、氣/質(zhì)聯(lián)用法操作復(fù)雜、占用時(shí)間長(zhǎng)[32]。試劑盒和酶聯(lián)免疫法只能針對(duì)單種成分等缺陷，使其在應(yīng)用于大量樣品實(shí)施初篩和監(jiān)測(cè)工作中受到了限制。因此，開(kāi)發(fā)多殘留分析的高通量檢測(cè)對(duì)于大規(guī)模樣品檢測(cè)任務(wù)是迫切需要的。

在睪丸酮叢毛單胞菌降解甾醇類化合物類固醇的過(guò)程中，隨著甾體類激素等誘導(dǎo)劑濃度的提高，阻遏蛋白的被抑制程度隨之增加，而3α-HSD的翻譯表達(dá)量相應(yīng)提高，在一定范圍內(nèi)形成了與甾體類激素含量線性關(guān)系。C. testosterone 如作為在環(huán)境檢測(cè)中的指示菌種，通過(guò)ELISA 方法檢測(cè)其對(duì)3α-HSD蛋白的表達(dá)量，可以準(zhǔn)確地對(duì)環(huán)境樣品中睪丸酮或類固醇類激素的定性以及定量檢測(cè)。3α-HSD 是作為降解甾體化合物的關(guān)鍵酶，在檢測(cè)中可作為目標(biāo)蛋白為利用生物學(xué)方法檢測(cè)環(huán)境中類固醇類化合物的含量。研究人員[33]利用3α-HSD單克隆抗體，建立了水體或飼料中總甾體激素含量的雙抗夾心酶聯(lián)免疫反應(yīng)（ ELISA）。當(dāng)甾體激素的量在0.5～600 μg·g-1之間，與3α-HSD酶表達(dá)量具有明顯線性關(guān)系。

目前，為建立廣譜的激素篩查技術(shù)，筆者所在課題組在前文所述的高純度蛋白基礎(chǔ)上，已研制出高效價(jià)比的3α-HSD單克隆抗體。與傳統(tǒng)的HPLC技術(shù)在靈敏度方面進(jìn)行比較，建立于高效價(jià)比基礎(chǔ)上的雙抗夾心ELISA法具有高靈敏度和高通量等特點(diǎn)，可以同時(shí)檢測(cè)睪丸酮及與其結(jié)構(gòu)類似的一類物質(zhì)的量。在樣品多成分檢測(cè)中，這種新型的甾體激素檢測(cè)方法雖然無(wú)法專一性檢測(cè)某種特定成分，但可用于監(jiān)測(cè)環(huán)境中甾體激素污染整體情況和食物、飼料中類固醇類有害成分的快速初篩[34]。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

由于人類工業(yè)革命的發(fā)展，大量的激素類化合物被排放到空氣、水、土壤中，自然環(huán)境承受多種污染破壞，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和自然生態(tài)平衡面臨著巨大壓力。這些有毒化學(xué)物質(zhì)通過(guò)食物鏈的轉(zhuǎn)移以及生活中直接接觸吸收等多種方式，直接或間接地威脅著處于食物鏈頂端的人類，包括雄酮等類固醇類激素物質(zhì)誘導(dǎo)造成的癌癥、不孕癥等各類疾病，是人類健康的大敵[28-29]。由于3α-HSD是睪丸酮叢毛單胞菌（C. testosteroni）的關(guān)鍵酶，即具有脫氫降解功能又可以起到還原作用，尤其是經(jīng)過(guò)改良后的各類工程菌在保證穩(wěn)定性的前提下將具有廣泛的應(yīng)用范圍。在環(huán)境修復(fù)領(lǐng)域，3α-HSD可在農(nóng)業(yè)上作為飼料食品添加劑及含有芳類物質(zhì)肥料的降解物.還可以消化雌性激素類物質(zhì)及動(dòng)植物分泌的生理活性物中難降解多環(huán)芳烴類和甾體類化合物，也可用于土壤、水源等環(huán)境因子的修復(fù)[35-36]。另外，在植物修復(fù)領(lǐng)域，根據(jù)植物通過(guò)吸收、降解以及根際圈降解等方式將徹底去除環(huán)境中污染物的功能，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將睪丸酮叢毛單胞菌中的降解關(guān)鍵酶基因 3α-HSD 導(dǎo)入到植物中去，彌補(bǔ)植物缺乏微生物的有機(jī)物降解能力，具有處理費(fèi)用相對(duì)低廉、對(duì)環(huán)境擾動(dòng)少和資源可持續(xù)利用的特點(diǎn)，會(huì)進(jìn)一步提高生物修復(fù)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。在檢測(cè)領(lǐng)域，通過(guò)制備高純度的3α-HSD抗原和相應(yīng)的多克隆與單克隆抗體，進(jìn)一步建立和完善能夠快速檢測(cè)多環(huán)芳烴類和甾體類化合物的免疫學(xué)方法將有望成為新的重點(diǎn)研究方向。

參考文獻(xiàn)：

[1] Talalay P，Doboson N D，TapIey D F. Oxidative degradation of testosterone by adaptive enzymes[J]. Nature，1952，170 （4 328）：620-62l.

[2] Boyer J， Baron D N， Talaly P. Purification and properties of 3α-hydroxysteroid dehydrogenase[J]. Biochemistry， 1965， 4 （19） ： 1 825-1 833.

[3] Mobus E， Maser E. Molecular cloning，overexpression and characterization of steroid-inducible 3α-hsdroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase from Comamonas testosterone， a novel member of the short-chain dehydrogenase/reductase superfamily[J]. Biol Chem，1998，273 （473）：30 888-30 896.

[4] Xiong G， Martin H J， Blum A，et al.A model on the regulation of 3α-hsdroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase expression from Comamonas testosterone[J]. Biol Chen，276（130-132）：961-970.

[5] Mobus E， Maser E. Cloning and sequencing of a new Comamonas testosteroni gene encoding 3 alpha- hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase[J]. Adv Exp Med Biol ， 1999， 463： 395-402.

[6] Browning D F， Busby S J W. The regulation of bacterial transcription initiation[J]. Nature Reviews.Microbiology， 2004，2（1）：57-65.

[7] Dai Y M， Zhou Y F， Xiong G M， et al. Expression of Activator from Comamonas testosteroni with tac promoter containing different 10 consensus sequences[J]. Journal of Agricultural Biotechnology， 2005， 13（6）：747-753.

[8] Dai Y M， Pan D R， Xiong G M， et al. Construction and over-expression of the activator gene from Comamonas testosteroni[J]. Journal of Agricultural Biotechnology， 2006，14（3）：416-422.

[9] Dai Y M， Zhou Y F， Chen J C， et al. Construction and stability analysis of the engineered Comamonas testosterone[J]. Journal of Agricultural Biotechnology， 2010，18（4）：807-814.

[10] Chen J Q， Pan D R， AI F Y， et al. TeiR-disrupted mutant of Comamonas testosteroni construction and its characteristics in steroid biodegradation[J]. Chin J Appl Environ Biol， 2009，15（6）：830-834.

[11] Pruneda-Paz J L， Linares M， Cabrera J E， et al. TeiR， a LuxR type transcription factor required for testosterone de gradation in Comamonas testosteroni[J]. Bacterio， 2004， 186（ 5） ： 1 430-1 437.

[12] Monferrer D， Tralau T， Kertesz M A， et al， Usón I.Structural studies on the full length LysR-type regulator TsaR from Comamonas testosteroniT-2 reveal a novel open conformation of the tetrameric LTTR fold[J]. Mol Microbio， 2010， 75（ 5） ： 1 199-1 214.

[13] Li M T， Wang Q S， Yu Y Y. Cloning of LysR gene from Comamonas testosteroni and its regulationfor expression of 3α-HSD/ CR in E. coli HB101[J]. Journal of Jilin Agricultural University，2011， 33（6）： 624-627.

[14] Jez J M，Bennett M J，Schlegel B P.Comparative anatomy of thealdo-keto reductase superfamily[J]. Biochem J，1997，326（3）：625-636.

[15] Joernvall H ， Persson B， Krook M， et al.Short-chain dehydrogenasea/ reductases （SDR） [J]. Biochemistry，1995，34（18）：6 003-6 013.

[16] Mobus E，Jahn M，Schmid R，et al.Testosterone-regulated expression of enzymes involved in steroid and aromatic hydrocarbon catabolism in Comamonas testosteroni[J]. Bacteriol， 1997，179（18）：5 951-5 955.

[17] Zhang G H， Cong A R， Xu G B.Isolation and identification of Comamonas testosteroni：Cloning and over expression of 3α-hydroxysteroid dehydrogenase in E. coli.[J]. Journal of Peking University（Health Sciences）， 2005，37（2）：203-206.

[18] Ke Y F， Lu G J， Hou L L， et al. Cloning and expression of 3α-hydroxysteroid dehydrogenase gene in E. coli[J]. Chinese Journal of Microecology， 2009， 21（9）：822-825.

[19] Xiao L， Xue Q， Zhou M Q， et al.Effective expression and purification of 3α-HSD protein from Comamonas testosterone[J]. Journal of China Agricultural University， 2013，18（1）：142-146.

[20] Xu Y， Yang C G. A method of the enzymatic cycling assay for total bile acids in serum[J]. Journal of Clinical Laboratory Science， 2002， 20（1）：11-12.

[21] Mashige F，Tanaka N，Maki A，et al. Direct spectrophotometry of totalbile acids in serum[J]. Clin Chem，1981，27（8）：1 352-1 356.

[22] Komiyama Y，Adachi T，Ito Y，et al. Microassay of serum bile acidsby an enzymatic cycling method[J]. Chem Pharm Bull，1982，30（10）：3 796-3 799.

[23] 鄒洪興，裘靖紅.酶循環(huán)法測(cè)定血清總膽汁酸[J].陜西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，1999，14（4）：35-36.

[24] SkaIhegg B A. On the 3α-hydroxysteroid dehydrogenase from Pseudomonas testosteroni purification and properties[J]. Eur J Biochem，1974，46（1）：117-125.

[25] Wang J J. Research on 3α-HSD/CR-aiiA gene co-transformation of rice by agrobacterium tumefaciens mediated method[D]. Fuzhou： FuJian Agriculture and Forestry University， 2012.

[26] Ying W W. Transformation of fuse gene 3α-HSD/CR- aiiA and two singal genes 3α-HSD/CR and aiiA in tobacco and expression analysis[D]. Fuzhou： FuJian Agriculture and Forestry University，2012.

[27] Zhang B B. Research on agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of gene 3α-HSD to chewing cane[D]. Fuzhou： FuJian Agriculture and Forestry University， 2012.

[28] Du K J， Xu X B. Advance in the research on environmental Etrogens[J]. Kexue Tongbao （Chinese Science Bulletin）， 2000， 45（21）： 2 241-2 251.

[29] Danzo B J. Environmental xenobiotics may disrupt normalendocrine function by interfering with the binding of physiological ligands to steroid receptors and binding proteins[J]. Environmental Health Perspectives， 1997，105（3）：294-301.

[30] Hauwea O V， Dumoulin F， Antignac J P， et al. Liquid chromatographic - mass spectrometric analysis of 11 glucocorticoid residues and an optimization of enzymatic hydrolysis conditions in bovine liver[J]. Analytica Chimica Acta， 2002， 473（1-2）： 127-134.

[31] Monica M. Effect of the systemic versus inhalatory administration of synthetic glucocorticoids on the urinary steroid profile as studied by gas chromatography-mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta， 2006， 559（1）： 30-36.

[32] Chen X， Dong W F， Zhao J H， et al. Determination technology of residual anabolic steroid hormones [J]. Inspection and Quarantine Science， 2007，17（z1）：93-98.

[33] Yu Y H，Diao Y W，Ma D Z，et al. Expression and contection of 3-HSD in different bacteria by the induction of testosterone[J]. Journal of Changchun University of Science and Technology（Natural Science Edition），2007，30（4）：63-65.

[34] Ma D Z， Yang J X. ELISA detection of steroidal hormones in water resources，food and feed[J]. Chinese Journal of Applied Chemistry， 2010，27（12）：1466-1469.

[35] Maser E， Mobus E， Xiong G.Funcitonal expression，purification，and characterization of 3α-hsdroxysteroid dehydrogenase / carbonyl reductase from Comamonas testosterone[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2000， 272（2）：622-628.

[36] Maser E， Xiong G. 3α-hsdroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase from Comamonas testosterone： Biological significance，three-dimensional structure and gene regulation[J]. Chem Biol Interact，2001，130-132（1-3）： 707-722.

[31] Monica M. Effect of the systemic versus inhalatory administration of synthetic glucocorticoids on the urinary steroid profile as studied by gas chromatography-mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta， 2006， 559（1）： 30-36.

[32] Chen X， Dong W F， Zhao J H， et al. Determination technology of residual anabolic steroid hormones [J]. Inspection and Quarantine Science， 2007，17（z1）：93-98.

[33] Yu Y H，Diao Y W，Ma D Z，et al. Expression and contection of 3-HSD in different bacteria by the induction of testosterone[J]. Journal of Changchun University of Science and Technology（Natural Science Edition），2007，30（4）：63-65.

[34] Ma D Z， Yang J X. ELISA detection of steroidal hormones in water resources，food and feed[J]. Chinese Journal of Applied Chemistry， 2010，27（12）：1466-1469.

[35] Maser E， Mobus E， Xiong G.Funcitonal expression，purification，and characterization of 3α-hsdroxysteroid dehydrogenase / carbonyl reductase from Comamonas testosterone[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2000， 272（2）：622-628.

[36] Maser E， Xiong G. 3α-hsdroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase from Comamonas testosterone： Biological significance，three-dimensional structure and gene regulation[J]. Chem Biol Interact，2001，130-132（1-3）： 707-722.

[31] Monica M. Effect of the systemic versus inhalatory administration of synthetic glucocorticoids on the urinary steroid profile as studied by gas chromatography-mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta， 2006， 559（1）： 30-36.

[32] Chen X， Dong W F， Zhao J H， et al. Determination technology of residual anabolic steroid hormones [J]. Inspection and Quarantine Science， 2007，17（z1）：93-98.

[33] Yu Y H，Diao Y W，Ma D Z，et al. Expression and contection of 3-HSD in different bacteria by the induction of testosterone[J]. Journal of Changchun University of Science and Technology（Natural Science Edition），2007，30（4）：63-65.

[34] Ma D Z， Yang J X. ELISA detection of steroidal hormones in water resources，food and feed[J]. Chinese Journal of Applied Chemistry， 2010，27（12）：1466-1469.

[35] Maser E， Mobus E， Xiong G.Funcitonal expression，purification，and characterization of 3α-hsdroxysteroid dehydrogenase / carbonyl reductase from Comamonas testosterone[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2000， 272（2）：622-628.

[36] Maser E， Xiong G. 3α-hsdroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase from Comamonas testosterone： Biological significance，three-dimensional structure and gene regulation[J]. Chem Biol Interact，2001，130-132（1-3）： 707-722.