王振華 楊芳紅 孫怡 王輝 薛峰

卡介菌多糖核酸對尖銳濕疣患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞的影響

王振華 楊芳紅 孫怡 王輝 薛峰

目的探討卡介菌多糖核酸(BCG-PSN)對尖銳濕疣(CA)患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞(Treg細胞)的影響。方法42例首次發(fā)病的CA患者分成聯(lián)合治療組(26例)和電灼組(16例)，聯(lián)合治療組給予電灼后肌內注射BCG-PSN 0.35 mg隔日1次連續(xù)3個月，電灼組只進行電灼治療，在初診時和3個月后分別進行Treg細胞的檢測，觀察療效及Treg細胞水平的變化。另有健康體檢者30例作為健康對照組。結果CA患者外周血Treg細胞水平明顯高于健康對照組(8.31%±1.24%比5.15%±0.72%，P＜0.01)，其中復發(fā)組較未復發(fā)組高(9.34%±0.72%比7.45%±0.85%，P＜0.01)；聯(lián)合治療組復發(fā)率明顯低于電灼組(30.77%比68.75%，P＜0.05)，3個月后Treg細胞水平下降，明顯低于電灼組(5.87%±1.05%比6.60%±0.75%，P＜0.05)。結論Treg細胞比值的高低與CA患者疾病的轉歸有密切的關系，比值越高越容易復發(fā)。BCG-PSN可通過降低Treg細胞的數(shù)量來調節(jié)CA患者的抗病毒免疫應答，改善其預后。

尖銳濕疣；卡介菌多糖核酸；CD4-陽性T淋巴細胞；FoxP3

尖銳濕疣(condyloma acuminata，CA)是人乳頭瘤病毒(HPV)感染導致的復發(fā)率較高的性傳播性疾病，其發(fā)病、復發(fā)與機體的免疫功能有密切關系。CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞(Treg細胞)是受關注的免疫細胞，有研究證實，Treg細胞與CA的發(fā)病有密切相關性[1-2]?？ń榫嗵呛怂?BCGPSN)是從卡介菌中提取的一種具有免疫調節(jié)功能的物質，在CA的治療中發(fā)揮著一定的作用。為進一步探討Treg細胞與CA的關系以及BCG-PSN對CA患者外周血Treg細胞的影響，我們應用BCG-PSN聯(lián)合電灼治療CA并觀察了治療前后Treg細胞水平的變化，報告如下。

一、對象和方法

(一)對象:2012年10月至2013年9月來我科門診就診的首次發(fā)病CA患者42例，其中男30例，女12例；年齡19～52歲，平均(31.02±8.37)歲；病程(21.71± 9.69)d，皮損0.3～3 cm，數(shù)目4～35個，平均(15.83±7.41)個。 所有入選病例均具有典型的臨床表現(xiàn)，皮疹醋酸白試驗陽性，有非婚性接觸史。排除標準:有自身免疫性疾病、惡性腫瘤、合并其他性病或者感染性疾病、嚴重肝腎功能不全、妊娠、近半年內應用糖皮質激素等免疫抑制劑或者免疫調節(jié)劑者。另外選取我院體檢中心健康體檢者30例作為健康對照組。兩組的年齡、性別經統(tǒng)計學分析差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性(P＞0.05)。

(二)方法:

1.試劑與儀器:熒光標記單克隆抗體CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PE 及同型對照小鼠 IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-APC、熒光標準微球及破膜固定液均為美國BD公司產品。淋巴細胞分離液購自中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所。流式細胞儀FACSCalibur為美國BD公司生產。

2.實驗方法:抽取靜脈血4 ml，肝素抗凝。Ficoll密度梯度離心法用淋巴細胞分離液常規(guī)分離單一核細胞，調整細胞數(shù)為10×106/ml，取兩支試管，分別加入100 μl細胞懸液(1×106)，分為同型對照管和檢測管。同型對照管加小鼠IgG1-FITC及 IgG1-APC 10 μl， 檢測管加 CD4-FITC及CD25-APC 10 μl熒光標記單抗，室溫避光孵育30 min；PBS洗滌后，固定破膜，然后同型對照管加IgG1-PE、檢測管加Foxp3-PE抗體各10 μl，室溫避光孵育30 min。PBS洗滌后，重懸細胞，上機測定。Treg細胞以CD4+CD25+Foxp3+T細胞/CD4+T細胞比值表示。

3.治療方法:將CA患者分為兩組，完成隨訪者42例，其中聯(lián)合治療組26例，電灼組16例。聯(lián)合治療組在常規(guī)消毒后局部浸潤麻醉，外涂5%醋酸以顯示亞臨床病灶，之后應用GX-Ⅲ型多功能電離子治療機(廣西科學院應用物理研究所)對皮損進行電灼祛除，之后應用BCG-PSN(商品名迪蘇，浙江萬馬藥業(yè)有限公司)肌內注射，隔日0.35 mg，連續(xù)3個月，電灼組只進行電灼祛除皮損。兩組患者隨訪時若發(fā)現(xiàn)CA復發(fā)則繼續(xù)給予電灼治療。為保證可比性，所有電灼治療操作由同一組醫(yī)護人員完成。

所有CA患者初次就診時詳細記錄其皮損的部位、數(shù)量、病程并檢測Treg細胞比值，以后每半個月隨訪1次，連續(xù)3個月，觀察療效及不良反應。隨訪結束再檢測1次Treg細胞比值。祛除皮損后連續(xù)3個月不復發(fā)判為痊愈，3個月隨訪期間皮損又出現(xiàn)則判為復發(fā)。

4.統(tǒng)計學處理:應用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學處理，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，率的比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

二、結果

1.CA患者Treg細胞占CD4+T細胞的百分比較健康對照組者顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義，見表1。聯(lián)合治療組26例CA患者在隨訪期間復發(fā)8例，復發(fā)率30.77%，而電灼組16例中復發(fā)11例，復發(fā)率68.75%，二者相比差異有統(tǒng)計學意義，χ2=5.77，P＜ 0.05。 見表1。

2.聯(lián)合治療組和電灼組在初次就診時Treg細胞占CD4+T細胞的百分比差異無統(tǒng)計學意義；3個月隨訪結束該數(shù)值在兩組中都較初次就診時下降(均P＜0.01)，但是聯(lián)合治療組下降更為明顯，二者相比差異有統(tǒng)計學意義，見表2。

3.不良反應:聯(lián)合治療組和電灼組均未出現(xiàn)不良反應。

三、討論

Treg細胞能夠通過抑制抑制CD4+和CD8+細胞的IL-2基因的轉錄和表達來抑制T細胞的活化和增殖，并能控制由樹突細胞誘導的Th1和Th2的分化，從反向調節(jié)機體抗病毒免疫應答的強弱程度，影響細胞介導的免疫保護作用，并形成持續(xù)感染[1，3]。我們研究發(fā)現(xiàn)，CA患者外周血Treg細胞占CD4+T細胞的百分比較健康對照組者顯著升高，其中復發(fā)組又較未復發(fā)組高，這與以往的研究結果一致[1，4]，提示CA患者體內存在明顯的免疫抑制狀態(tài)，而Treg細胞比值的高低與CA患者疾病的轉歸又有密切的關系，比值越高越容易復發(fā)。

表1 尖銳濕疣患者和健康對照組外周血Treg細胞占CD4+T細胞的比值(±s)

表1 尖銳濕疣患者和健康對照組外周血Treg細胞占CD4+T細胞的比值(±s)

注:a:與健康對照組比較，P＜0.01；b:與未復發(fā)組比較，P＜0.01

組別 例數(shù) Treg細胞比值(%)尖銳濕疣組 42 8.31±1.24a復發(fā)組 19 9.34±0.72b未復發(fā)組 23 7.45±0.85健康對照組 30 5.15±0.72

表2 聯(lián)合治療組和電灼組外周血Treg細胞占CD4+T細胞治療前后的比值(%，±s)

表2 聯(lián)合治療組和電灼組外周血Treg細胞占CD4+T細胞治療前后的比值(%，±s)

注:a:治療前后比較，均P＜0.01

組別 例數(shù) 初診時Treg細胞比值隨訪結束時Treg細胞比值(%)聯(lián)合治療組 26 8.03±1.19 5.87±1.05a電灼組 16 8.76±1.21 6.60±0.75a t值 1.916 2.390 P值 ＞0.05 ＜0.05

有學者觀察到，BCG-PSN能使CA患者外周血CD4+/CD8+比值和IL-2水平升高，使CD8+百分率和可溶性白細胞介素2受體(sIL-2R)水平降低，提示BCG-PSN對CA患者的免疫功能有良好的調節(jié)作用[5]。我們研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療組CA患者應用BCG-PSN3個月后，其復發(fā)率明顯低于電灼組，而且其外周血Treg細胞占CD4+T細胞的百分率明顯下降，低于原本差異無統(tǒng)計學意義的電灼組CA患者的相關數(shù)值，提示BCG-PSN能逆轉CA患者的免疫抑制，能通過降低Treg細胞的數(shù)量來正向調節(jié)CA患者的抗病毒免疫應答，改善CA疾病的預后和轉歸。至于具體機制，尚待進一步研究。

[1]錢起豐，盧創(chuàng)林，張明霞.CA患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞的檢測[J].中華皮膚科雜志，2008，41(5)：311-313.

[2]劉慧賢，王振華.CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞與HPV感染的相關性[J].中國麻風皮膚病雜志，2013，29(5)：328-330.

[3]Sakaguchi S，Yamaguchi T，Nomura T，et al.Regulatory T cells and immune tolerance[J].Cell，2008，133(5)：775-787.

[4]Cao Y，Zhao J，Lei Z，et al.Local accumulation of FOXP3+regulatory T cells：evidence for an immune evasion mechanism in patients with large condylomata acuminata[J].J Immunol，2008，180(11)：7681-7686.

[5]肖嶸，李干群，張桂英，等.卡介菌多糖核酸對尖銳濕疣患者的免疫調節(jié)作用及臨床療效[J].中華皮膚科雜志，2001，34(3)：214.

2014-02-26)

(本文編輯:吳曉初)

Effect of polysaccharide nucleic acid fraction of bacillus Calmette-Guerin on CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells in peripheral blood of patients with condyloma acuminatum

Wang Zhenhua，Yang Fanghong，Sun Yi，Wang Hui，Xue Feng.Department of Dermatology，Weifang People's Hospital，Weifang 261041，Shandong，China

Wang Zhenhua，Email：wfzcwzh@126.com

ObjectiveTo evaluate the effect of polysaccharide nucleic acid fraction of bacillus Calmette-Guerin(BCG-PSN)on peripheral blood CD4+CD25+Foxp3+regulatory T(Treg)cells in patients with condyloma acuminatum(CA).MethodsForty-two patients with first onset of CA were randomly assigned to receive either injection of BCG-PSN(0.35 mg every other day for 3 months)after fulguration(combination group，26 patients)，or fulguration only(fulguration group，16 patients).Venous blood samples were obtained from all the patients at the initial visit and three months after the beginning of treatment，as well as from 30 healthy checkup examinees.The percentage of peripheral Treg cells in CD4+T lymphocytes was determined by flow cytometry.The recurrence of CA was evaluated during the three months after the beginning of treatment.ResultsThe percentage of peripheral Treg cells in CD4+T lymphocytes was significantly higher in patients with CA than in the controls(8.31%±1.24%vs.5.15% ±0.72%，P＜0.01)，and in patients with clinical recurrence of CA than in those without(9.34% ±0.72%vs.7.45% ±0.85%，P＜0.01).The recurrence rate was significantly lower in the combination group than in the fulguration group(30.77%vs.68.75%，P＜ 0.05).After three months of treatment，the combination group showed lower percentage of Treg cells in CD4+T cells compared with the fulguration group(5.87%±1.05%vs.6.60%±0.75%，P＜0.05).Conclusions The percentage of Treg cells has a close relationship with the progression of CA，i.e.，the higher the percentage，the more frequent the relapse.BCG-PSN may enhance the antiviral immune response in patients with CA and improve their prognosis by reducing the number of Treg cells.

Condylomata acuminata；BCG-PSN；CD4-positive T-lymphocytes；FoxP3

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.09.018

261041山東，濰坊市人民醫(yī)院皮膚科

王振華，Email:wfzcwzh@126.com