黃新次

武漢市普愛(ài)醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北武漢 430033

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)在2013年全球共有超過(guò)1500 萬(wàn)人死于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟病[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)冠心病的危險(xiǎn)因素眾多包括血脂代謝、高血壓、高血糖、肥胖、吸煙、高尿酸血癥等等[2]。近幾年來(lái)隨著分子遺傳學(xué)的高速發(fā)展,學(xué)者們發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性與冠心病有密切的聯(lián)系[3]。因此筆者擬收集該院心血管內(nèi)科100 例診斷為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟病的病人作為研究組，同期100 例來(lái)該院進(jìn)行健康體檢未患冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟病的正常人作為對(duì)照組，收集時(shí)間為2011年4月—2014年4月，目的為調(diào)查冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟病的病人與健康人群中9、11 號(hào)外顯子多態(tài)性位點(diǎn)（891C/T 中TT、CT；1294～1296CCG 中DD、DW；1305G/A中AA、GA）中的突變頻率。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集該院心血管內(nèi)科100 例診斷為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟病的病人作為研究組，同期100 例來(lái)該院進(jìn)行健康體檢未患冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟病的正常人作為對(duì)照組。研究組，平均年齡（45.2±6.9）歲，其中男性55 人，女性45 人；對(duì)照組，年齡（47.1±5.5）歲，其中男性60 人，女性40 人。2 組人員性別，年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有研究對(duì)象均簽定知情同意書(shū)。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn)

入選標(biāo)準(zhǔn)：①就診時(shí)臨床資料、治療經(jīng)過(guò)完整。②冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟病的診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)心內(nèi)科學(xué)分會(huì)關(guān)于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟病的診斷與鑒別診斷[4]。③每個(gè)研究對(duì)象能自愿參與該次研究。

1.3 排除指標(biāo)

①入院時(shí)生命體征不平穩(wěn)的患者。②有各種急性、慢性感染,嚴(yán)重肝、腎功能不全,惡性腫瘤,自身免疫性疾病者，藥物有過(guò)敏、惡性心律失常者。③對(duì)照組中患有冠心病、或有冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟病家族史。

1.4 研究方法

1.4.1 主要試劑 TaqDNA 聚合酶；EZNA 膠回收試劑；DTCS StartDNA 試劑盒。

1.4.2 儀器與材料 PCR 儀器、垂直電泳槽及電泳儀(上海精密儀器有限公司)、凝膠成像儀、TICK400-測(cè)序儀、日本島津UV265 紫外分光儀。

1.4.3 引物和探針 引物由日本TEIL 杭州生物公司合成,引物序列參考Lusis AJ 等[7]的研究,其余引物用FACE-maker 軟件自行設(shè)計(jì)。

1.4.4 DNA 提取 用EDTA 抗凝收集研究對(duì)象外周血5 mL，采用鹽析法提取基因組DNA。

1.4.5 PCR 擴(kuò)增 使用40 μl 反應(yīng)體系,PCR 緩沖液,NaCl 為2.0 mmol/L,1 μmol/L 上下游引物,0.2 mmol/LdNTP,Taq DNA 聚合酶0.8 U。循環(huán)參數(shù)如下:5 min 94 ℃預(yù)變性,退火20 s,72 ℃延伸20 s,循環(huán)40 次。從基因組DNA 中擴(kuò)增MEF2A 基因的外顯子。

1.4.6 SSCP 分析 8 μlPCR 擴(kuò)增產(chǎn)物和2 μl 緩沖液混合,先96 ℃加熱10 min 后立即冰浴,上樣于聚丙烯酰胺凝膠,240 V 電泳3 h,銀染。

1.4.7 DNA 測(cè)序 PCR 產(chǎn)物全部上樣瓊脂糖凝膠，用E·EZNA 膠回收試劑純化產(chǎn)物。PCR 正向、反向引物擴(kuò)增,進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定,最終數(shù)據(jù)用DNA 分析軟件比對(duì),并用Chromas 軟件測(cè)定序列變異。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

將資料錄入SPSS18.0 軟件。計(jì)數(shù)資料采頻數(shù)描述，用χ2檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果

2.1 兩組人群9、11 號(hào)外顯子多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)

研究組和對(duì)照組MEF2A 基因的9 號(hào)外顯子多態(tài)性位點(diǎn)有891C/T 變異，11 號(hào)外顯子多態(tài)性位點(diǎn)有1294～1296CCG、1305G/A、1353G/T，見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 9 號(hào)外顯子多態(tài)性位點(diǎn)

圖2 11 號(hào)外顯子多態(tài)性位點(diǎn)

2.2 研究組和對(duì)照組9、11 號(hào)外顯子多態(tài)性位點(diǎn)突變頻率的比較

研究組與對(duì)照組891C/T 中TT、CT 點(diǎn)位突變頻率分別為（56%、43%；4%、8%）,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;研究組與對(duì)照組1294～1296CCG 中DD、DW 點(diǎn)位突變頻率分別為（46%、47%；9%、11%）,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;研究組與對(duì)照組1305G/A中AA、GA 突變頻率分別為（51%、37%；6%、7%）,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;研究組與對(duì)照組1353G/T 中GT、GG 點(diǎn)位突變頻率分別為（76%、54%；13%、12%）,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

表1 研究組和對(duì)照組9、11 號(hào)外顯子多態(tài)性位點(diǎn)突變頻率的比較

3 討論

MEF2A 基因廣泛在血管平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞中有表達(dá)，對(duì)冠狀動(dòng)脈的發(fā)育起重要作用[5]。有國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)白兔的MEF2A 存在多態(tài)性，因此采取基因酶切除法將白兔MEF2A 多態(tài)性點(diǎn)位切除，結(jié)果顯示10 d 后白兔血管異常,肌纖維破裂[6]。因此該研究認(rèn)為MEF2A 基因結(jié)構(gòu)位點(diǎn)多態(tài)性與冠心病可能密切相關(guān)。

該研究發(fā)現(xiàn)研究組和對(duì)照組中MEF2A 基因的9、11 號(hào)外顯子均存在多態(tài)性位點(diǎn)。9 號(hào)外顯子表明有891C/T 變異，11 號(hào)外顯子有1294～1296CCG、1305G/A、1353G/T 變異。但是該研究進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)：研究組與對(duì)照組891C/T 中TT、CT 點(diǎn)位突變頻率分別為（56%、43%；4%、8%）,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;研究組與對(duì)照組1294～1296CCG 中DD、DW 點(diǎn)位突變頻率分別為（46%、47%；9%、11%）,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;研究組與對(duì)照組1305G/A 中AA、GA 突變頻率分別為（51%、37%；6%、7%）,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;研究組與對(duì)照組1353G/T 中GT、GG點(diǎn)位突變頻率分別為（76%、54%；13%、12%）,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）說(shuō)明891C/T，1294～1296CCG、1305G/A、1353G/T 點(diǎn)位的變異與冠心病的發(fā)病有關(guān)。國(guó)外同樣有報(bào)道，9 號(hào)外顯子表明有891C/T 變異，11 號(hào)外顯子有1294～1296CCG、1305G/A、1353G/T變異，與該次研究一致[8]。該研究發(fā)現(xiàn)11 號(hào)外顯子的3 個(gè)多態(tài)性點(diǎn)位離國(guó)際公認(rèn)的冠心病11 號(hào)外顯子21 bp 缺失點(diǎn)位非常接近，我們認(rèn)為可能的原因是MEF2A 基因第11 號(hào)外顯子中CAG重復(fù)序列（重復(fù)片段在5～20 個(gè)不等）使DNA 聚合酶的在復(fù)制階段產(chǎn)生錯(cuò)誤識(shí)別,DNA 復(fù)制錯(cuò)誤,這些錯(cuò)誤的片段沒(méi)有被酶切后，固定在DNA 長(zhǎng)鏈上后，導(dǎo)致第11 號(hào)外顯子顯示多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)[7]。研究發(fā)現(xiàn)MEF2A 基因11 號(hào)外顯子CAG 下游有脯氨酸重復(fù)序列，與冠心病密切相關(guān)，而這些重復(fù)的脯氨酸重復(fù)序列可以導(dǎo)致1294～1296CCG、1305G/A、1353G/T 點(diǎn)位的變異，與該次研究一致[9]。

綜上所述，MEF2A 作為肌細(xì)胞增強(qiáng)因子家族的一員，編碼轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)節(jié)心肌和骨骼肌細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[10]。筆者認(rèn)為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟病的病人MEF2A 基因結(jié)構(gòu)位點(diǎn)891C/T、1294～1296CCG、1305G/A、1353G/T 點(diǎn)位突變頻率明顯高于正常人，MEF2A 基因多態(tài)性與冠心病明顯相關(guān)。

[1]Dodou E,Sparrow DB,Mohun T,et al.MEF2 proteins,including MEF2A,are expressed in bothmuscle and non2muscle cells[J].Nucleic AcidsRes,2014,23(4).

[2]YusufS,Reddy S,Tnpuu S,et al.Globalburden ofcardiovascular diseases part I:general considerations,the epidemiologic transition,risk factors,and impact of urbanization[J].Circulation,2011,104(23).

[3]LusisAJ.Atherosclerosis[J].Nature,2012,407(11).

[4]Nora JJ,LortscherRH,SpanglerRD,et al.Genetic2epidemiologic study of early2onset ischemic heart disease[J].Circulation,2013,61(16).

[5]Schildkraut JM,Myers RH,Cupples LA,et al.Coronary risk associated with age and sex of parental heart disease in the Framingham Study[J].Am JCardio,2014,64(9).

[6]Olson EN.Coronary artery disease and the MEF2A transcription factor[J].SciAgingKnowlEnviron,2013,48(2).

[7]Lusis AJ,Fogelman AM,Fonarow GC.Genetic basis of atherosclerosis:part I,new genes and pathways[J]Circulation,2014,110(6).

[8]Lusis AJ,Fogelman AM,Fonarow GC.Genetic basis of atherosclerosis:partⅡ,clinical implications[J].Circulation,2014,110(34).

[9]McKinseyTA,Zhang CL,Olson EN.MEF2:a calcium dependeregulator of cell division,differentiation and death[J].Trends Biochem Sc,i 2002,27(8).

[10]Edmondson DG,LyonsGE,Martin JF,et a.l Mef gene expression marks the cardiac and skeletal muscle lineages during mouse embryogenesis[J].Development,2014,120(3).

[11]Black BL,Olson EN.Transcriptional control ofmuscle development bymyocyte enhancer factor22(MEF2)proteins[J].Annu RevCellDev Bio,2013,14(55).

[12]Wang LJ,Fan C,Topol SE,et al.Mutation of MEF2A in an inherited disorderwith features of coronary artery disease[J].Science,2014,302(5).